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今天为大家分享单细胞多组学文献2024年发表于《Blood》的《Integrative single-cell chromatin and transcriptome analysis of human plasma cell differentiation》。浆细胞是B细胞的分化终点，其分化机制可在体外培养中再现，但早期分化的转录和表观遗传程序尚未完全阐明。本文结合单细胞RNA测序与单细胞表观遗传学分析，探讨浆细胞分化的轨迹与调控网络。发现了前浆母细胞阶段显示了显著的异质性，并且该阶段的染色质开放区域富集AP-1家族转录因子的结合位点（如BATF3、FOS、BATF）。同时发现某些前浆母细胞已经完成表观遗传重塑，并启动未折叠蛋白反应，即将分化为浆细胞。接下来我们看下作者的研究思路。
一：正常 B细胞 向 浆细胞（PC） 分化过程中各个阶段的转录特征
研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析了B细胞向正常浆细胞分化（PCD）过程中四个阶段的转录特征（见图1A）。对6,392个细胞进行均一流形近似与投影（UMAP）分析，显示了三个主要群体：记忆B细胞（MBCs）、浆细胞（PCs）和前浆母细胞/浆母细胞（prePB/PB）（图1B）。MBC和PC群体的转录组特征高度特异，而prePB和PB之间未呈现明显区分，显示出显著的异质性。此外，不同健康供体来源的MBC生成的细胞群体之间无显著差异。每个阶段的基因表达特征由超过300个差异表达基因（DEGs）定义，可清晰区分各阶段（图1C）。prePB阶段表现出近2000个差异表达基因，是分化过程中变化最显著的阶段，显示重要的分子调控发生在此阶段。
正如预期，B细胞相关转录因子（PAX5、BCL6、BACH2）在MBCs中表达，而浆细胞转录因子（IRF4、PRDM1、XBP1）在PCs中显著表达（图1D）。通过前十显著DEGs的热图分析，不同阶段间的动态基因表达变化清晰可见（图1E）。接下来进一步聚焦三个关键转变阶段：
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MBC到prePB：B细胞激活后的早期转变。
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prePB到PB：细胞开始分泌抗体的阶段。
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PB到PC：浆母细胞向浆细胞分化。
基因集富集分析验证了这些阶段中差异基因的功能，并与先前基于RNA测序（bulk RNA-seq）的研究结果一致。
图1：B细胞向PC 分化过程中 MBC、prePB、浆母细胞和 PC 的单细胞转录组学分析
二：单细胞染色质可及性揭示了AP-1转录因子（TFs）在前浆母细胞阶段（prePB）显著富集
为了探讨B细胞分化至浆细胞（PCD）过程中染色质开放的变化，研究应用单细胞ATAC-seq技术（scATAC-seq），共分析了7721个单细胞。通过使用MACS2工具识别的染色质开放峰值，UMAP降维显示了MBC阶段与prePB、PB和PC阶段之间的明显分离（图2A）。prePB阶段具有最多的差异可及性峰（4660个），而其他阶段的峰数显著较少（MBC: 641个; PB: 44个; PC: 105个）（图2B）。
尽管转录组层面prePB和PB细胞表现出显著差异，但三者的ATAC-seq谱系在染色质结构上具有高度相似性。此外，prePB阶段表现出显著的染色质解压缩，伴随大量ATAC-seq峰的出现（图2B-C）。
研究进一步显示，通过scATAC-seq识别的差异可及区域与scRNA-seq鉴定的差异基因数高度相关（R²=0.9949，P<0.001）。这些差异可及性峰中，大部分位于基因上，而非远端调控元件（图2D）。两两比较显示，在B细胞激活后，MBC与prePB之间的染色质变化最为显著（MBC开放峰251个，prePB为4854个）（图2D-G）。
在ATAC-seq与RNA-seq共同分析的差异基因中，29个基因（MBC）、170个基因（prePB）和11个基因（PC）既表现出染色质重塑，也显示差异表达（图2H）。这些结果表明，B 细胞激活导致了主要的表观遗传和转录组重塑。同时作者也鉴定了一系列细胞亚群特异的转录因子:
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MBC阶段: FOXP1, PAX5
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prePB阶段: ARID3A, BATF, BATF3, E2F4, ETS1, IKZF1, IRF2, MYB, SOX4, SPIB, SREBF2, STAT3, TFDP1, ZNF511
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PC阶段: PRDM1.
JASPAR和CIS-BP数据库的motif富集分析验证了这些转录因子的显著富集，其中BATF3和BATF的差异可及性峰分布在核心基因及远端调控元件上（图2I）。prePB阶段中，差异可及峰富集了AP-1家族TF（如BATF3、FOS、BATF）的motif（图2J）。相比之下，MBC阶段的峰富集KLF4、SPIB和KLF9的motif，而PC阶段则富集TCF4、ASCL1和IRF4的motif。在单细胞层面，大多数prePB细胞中AP-1 TF家族（如BATF、BATF3、FOS等）表达为中到高水平（图2K）。
在prePB阶段的差异可及性峰中，38%富含BATF3的motif，潜在调控基因达1479个（图2L-M）。其中140个基因在prePB阶段上调，包括LDHA、EZH2、CXCR4、BIRC3、MKI67、TRAF1、IL21R、PAX5、CCL5、IKZF1、IRF5、CCR7等。BATF3蛋白在prePB中的显著过表达亦通过实验验证（补充图3A-B）。由于BATF3在prePB阶段以短暂脉冲方式发挥作用，其靶基因可能构成PCD关键转录节点。
图2：B 向 PC 分化过程中 MBC、prePB、浆母细胞和 PC 的单细胞染色质可及性变化
三：整合 scRNA-seq 和 scATAC-seq 揭示了一个更成熟的 prePB 亚群，其特征在于 PC 的表观遗传特征
为了整合scRNA-seq与scATAC-seq数据集，研究使用scRNA-seq数据集中每个阶段的前50个差异表达基因作为锚点，以预测scATAC-seq数据集中细胞的归属。针对scATAC-seq数据集，通过基因区域内的读取数计算基因活性矩阵。UMAP投影显示，整合后的scRNA-seq与scATAC-seq数据集，尤其在MBC与PC阶段的表现高度一致（图3A-B）。有趣的是，约一半的ATAC-seq数据中的prePB细胞未被预测为prePB，且接近四分之一的PB细胞未被预测为PB（图3C）。余下的prePB被预测为PB或PC，而余下的PB被预测为PC（图3D），这表明某些prePB与PB细胞具有更成熟的表观遗传特征。对比预测为prePB的prePB细胞与预测为PC的prePB细胞，研究发现了一些PC阶段的关键标志基因，包括XBP1、FAM46C、MZB1和BTG2（图3E；补充表2）。这表明，某些prePB亚群已发生与PC表观遗传特征相关的重塑。
通过RNA-seq数据表明，研究发现尽管某些PC基因（如IFI6）在prePB中已呈现开放染色质状态，但其表达水平仍显著低于成熟PC（图3F）。为了验证上述结果，研究进一步对组蛋白标记H3K4me3、H3K27ac和H3K36me3进行了ChIP-seq实验：H3K36me3: 与基因体内的转录延伸相关；H3K27ac: 与活跃的调控元件（包括增强子和启动子）相关；H3K4me3: 与活跃或多功能启动子相关。结果表明，PC标志基因（如FAM46C、XBP1、MZB1和IFI6）在prePB细胞中已显示出活跃染色质标记。这些数据表明，一部分prePB细胞已转变为生成抗体分泌细胞。
图3：scRNA-seq 和 scATAC-seq 数据集的整合
四：基于转录组对prePB 和 PB 亚群的拟时序分析
基于K近邻（KNN）聚类分析识别了7个亚群（图4A）：
• MBC: 位于Cluster 1
• prePB: 位于Clusters 2和3
• PB: 位于Clusters 4和5
• PC: 位于Clusters 6和7
约40%的分析细胞显示出与细胞周期S-G2-M阶段相关的转录特征（图4B-C），这些细胞主要由prePB和PB6组成（图4D-E）。研究仅选择了与S-G2-M阶段相关的prePB和PB细胞，以聚焦于prePB向PB过渡过程，并尽量减少细胞周期状态的偏倚（图5A）。为揭示潜在的分化轨迹及不同阶段间的进程，利用Monocle 3对细胞进行伪时间排序（图5B-C）。研究特别关注了沿该轨迹差异表达的基因，包括编码转录因子（TFs）、表观遗传调控因子及配体/受体相互作用蛋白的基因。通过伪时间分析，研究识别了6类差异表达基因：Cluster 1中下调的基因（早期prePB）；Cluster 2中下调的基因（成熟prePB）；Cluster 1中上调的基因；Cluster 2中上调的基因；先下调后上调的基因（impulsed down）；先上调后下调的基因（impulsed up）（图5D）。大多数差异表达基因表现为下调（占78.8%），其中52.5%集中在Cluster 2（图5E）。
在早期阶段下调的TFs包括：BATF3、IRF5、RUNX3、SPIB、PAX5、STAT5A、AHR、JUNB、STAT6和KLF6；在Cluster 2中下调的TFs包括：PHB2、TFAM、ETS1、TFDP1、YY1、E2F4、ZNF146、TP53、MAX和CEBPZ。
表观遗传因子中：从早期到成熟prePB阶段，下调的基因包括：AICDA、EZH2、EED、PRMT2和NCOA4；从prePB向PB过渡阶段，下调的基因包括：PCNA、PRMT1、SET、MBD2和HDAC1。蛋白水平验证显示，prePB中AID的表达伴随着显著诱导的53BP1和γH2AX，这表明存在DNA双链断裂。
配体/受体相互作用相关基因中：在早期prePB中下调的基因包括：IL2RA、IL21R和CD40；B细胞标志基因（如CD19、CD22、CD83、CCR7、CCL17和CCL22）在Cluster 1中下调；TACI的表达在Cluster 2中下调；PC表面标志基因（如CD27、CD38、SLAMF7、BCMA和ITGA4），以及IL-6R、IL-6ST和INSR在Cluster 1中上调。
图4：鉴定 B 到 PC 分化的不同阶段内的亚群
图5：prePB 和 PB 亚群的拟时序分析
五：基于单细胞转录组分析对 prePB 和 PB 阶段进行亚群分析
prePB阶段的异质性促使研究人员进行亚群分析，以识别新的过渡性prePB亚群。研究人员获得了5个cluster，其中包括4个prePB cluster和一个PB特异性cluster（图6A）。
利用拟时分析（图5F）鉴定的分化过程中失调的基因，研究人员按成熟度对cluster进行排序，特别是cluster 2、3和4，代表更成熟的prePB（图6B）。两两比较显示，基因表达变化在分化的早期阶段（cluster 1：684个差异表达基因）和晚期（cluster 5：437个差异表达基因）更为显著（图6C）。前50个差异表达基因的热图显示，cluster 1（早期prePB）和cluster 5（PB）具有非常特异的转录组特征（图6D）。在cluster 1（早期prePB）中，研究人员发现了多个在B细胞激活后强烈表达的配体和受体（图6D）。
此外，该cluster还表现出B细胞转录因子（IRF5、ZFP36L1、SPIB、BATF3、RUNX3和PAX5）（图6E）及AICDA的过表达。cluster 5（PB）显著表达多种PC受体，例如TNFRSF17（BCMA）、SLAMF7（CS1）、CD27、CD79A和CD38，以及PC转录因子XBP1和配体PSAP。成熟prePB被进一步划分为三个亚群：cluster 2（早期成熟prePB）、cluster 3（过渡性成熟prePB）和cluster 4（成熟prePB；图6D）。cluster 2中特异性表达的标志物包括ETS1和ATF5转录因子。ATF5是一种参与CREB3L2-ATF5-MCL1生存通路的转录因子。ETS1被认为能够调控MCL1抗凋亡因子的转录上调，并将AID招募至免疫球蛋白重链基因（IGH）位点。cluster 3中在更晚阶段表达了EGR1和FOS转录因子。EGR1参与程序性细胞死亡（PCD）途径。cluster 4（成熟prePB）和cluster 5（PB）中特异性表达KLF2（图6E）。KLF2通过控制β7整合素的表达参与控制PC在骨髓中的归巢过程。成熟prePB的各cluster还通过一些配体和受体基因的表达进行区分：cluster 2中表达CALR、HLA-DRB6、SLC1A5、NCL和CANX；cluster 3中表达GPI、CD70、HLA-DRB6和TFRC、CXCR4、ENO1、F2R；cluster 4中表达CCL3和ITGA4。基因集合富集分析显示，cluster 1富集了由NF-κB和STAT5调控的基因，这些基因分别响应TNF和IL-2刺激（图6F；补充表6）。
此外，该cluster还富集了与炎症反应和p53通路相关的基因，以及由磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号激活的基因。在所有其他cluster中，研究人员发现通过mTOR复合物1（mTORC1）激活的基因在cluster 2中富集程度更高。同时，在cluster 2中还观察到与未折叠蛋白反应（UPR）和MYC靶标相关的基因富集。这些基因集合在cluster 3中也有体现，此外还包括与氧化磷酸化、糖酵解以及细胞周期相关的E2F转录因子靶标基因。cluster 5显著富集了与蛋白分泌相关的UPR基因。
图6：鉴定prePB 和 PB 阶段的新亚群
六：prePB和PB转变过程中UPR的双重激活
研究人员重点关注在更成熟的 prePB 的第一个cluster和之后的 PB 中观察到的内质网应激的双重激活。对cluster 2与其相邻的cluster 1、3和4进行两两比较，结果显示在cluster 2中有111个基因过表达，其中19个基因（ASNS、SLC7A5、HSPA5、HSP90B1、CALR、HSPA9、SERP1、PSAT1、SSR1、EDEM1、XPOT、TARS1、SPCS3、DNAJC3、PDIA6、HYOU1、EIF4EBP1和HERPUD1）与UPR相关（图7A-C）。cluster 5相比于cluster 4有179个基因过表达，其中10个基因与内质网应激相关。在这些基因中，有5个基因在cluster 2和5中均被发现，而5个基因是cluster 5所特有的（图7B-C）。研究人员还比较了在cluster 2和5中上调的基因，以识别其他可能参与UPR的基因（图7D）。
在小鼠中的报道所示，prePB中的第一次UPR激活与参与mTORC1信号通路的基因过表达相关，而第二次激活则与mTORC1信号基因的下调以及与蛋白分泌相关基因的过表达相关（图7E-F）。UPR相关基因的热图显示了早期成熟prePB（cluster 2）中的首次激活与PB和PC中与蛋白分泌相关的第二次激活之间的显著区别（图7G）。早期UPR激活伴随着ASNS、SLC7A5、HSPA5、PSAT1、XPOT和EIF4EBP1的强表达，而第二次激活则表现为PC中TMBIM6、HERPUD1、VIMP和XBP1的强表达。有趣的是，HSPA5（编码一种名为结合免疫球蛋白蛋白的热休克蛋白70家族成员）仅与三个内质网应激跨膜传感器之一在cluster 2中共表达（图7H）。
有趣的是，在cluster 2中，研究人员观察到免疫球蛋白轻链和重链对应的reads比例不平衡（图7I），IGH对应的reads数量高于免疫球蛋白轻链基因（IGL），这可能解释了BiP从其特定时刻的内腔区域释放。在cluster 2中，仅激活了已知剪接XBP-1（sXBP-1）以产生高活性转录因子（TF）的Ire1通路。此外，负责sXBP1连接的连接酶在cluster 2中也有共表达，而拟时分析显示HSPA5的表达领先于XBP1的强表达（图7J）。研究人员还检测到一些sXBP1 reads，确认了早期成熟prePB中首次UPR激活后发生了XBP-1的剪接。在蛋白水平上验证了prePB中BiP的表达及XBP1剪接的诱导。
为了探讨mTORC1介导的UPR激活在PCD中的作用，研究人员使用了mTORC1的急性抑制剂雷帕霉素。该药物分别在第2天到第4天或第2天到第7天期间添加，以研究其对prePB的影响。当从第2天到第4天使用雷帕霉素时，显著影响了MBCs激活后的增殖。在第4、7和10天，细胞总数分别显著减少了51%、75%和56%。雷帕霉素在第4、7和10天时并未显著影响细胞活力。在细胞水平上，第4天时prePB的百分比未受到雷帕霉素的影响。相反，在第7天，prePB的百分比显著增加，而PB的百分比在mTORC1抑制下显著减少。在第10天，成熟PC的百分比显著减少。当从第2天到第7天使用雷帕霉素时，治疗产生了相同的效果，导致PCD受到抑制。PI3K抑制剂idelalisib被用作对照。PI3K抑制显著影响了增殖，但对PCD并未显著影响。
第二次UPR激活始于cluster 5，显然与免疫球蛋白基因的表达相关（图7K）。总体来看，这些数据表明，prePB通过mTORC1通路的激活已经启动UPR，为PC功能做准备，XBP1驱动的UPR激活随后将在PB中协调进行，以应对抗体合成的增加。
为了验证的结果，研究人员使用了人类扁桃体图谱数据。在由209,786个细胞构成的人类扁桃体图谱数据集中，研究人员选择了处于S期和G2/M期的生发中心B细胞和PC。研究人员鉴定出了一种prePB亚群，其特点是MS4A1和CD38表达水平较低，同时伴随BATF、BATF3、EZH2、MYB、BLM、AICDA、NSD2和PCNA的高表达（补充图11E-G）。这些prePB在MYC靶基因、E2F靶基因、mTORC1信号、氧化磷酸化、糖酵解和炎症反应方面表现出显著富集，这些特征已在研究人员的体外PCD模型中的prePB中被鉴定（图6F）。综合来看，这些结果表明在人类扁桃体中发现了转化阶段的prePB细胞，这与先前的报道一致。
图7：prePB 和 PB 阶段 UPR 的双重激活
结语
至此这篇文章已经介绍完了，总的来说这篇文章结合了单细胞转录组与ATAC，详细的刻画了B细胞到浆细胞的各个时期转变的特征。文章结构清楚，值得研究细胞发育的小伙伴们借鉴，同时数据分析也很清晰，适合设计了单细胞转录组和ATAC实验的小伙伴们参考。
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