基于单细胞 RNA 测序与胞外蛋白质联合检测的技术，成功揭示了与疾病相关的新型细胞类型及状态。
蛋白质作为细胞功能的主要执行者，广泛参与细胞结构构建与各类生理活动，其表达谱是界定细胞类型与状态的关键依据。尽管 RNA 转录本常被用于表征蛋白质表达，然而蛋白质与 mRNA 的丰度并非简单的线性对应关系。由于转录后调控、翻译效率及蛋白质降解等多重机制的影响，二者的丰度差异普遍存在，这种动态调控过程使得仅通过 mRNA 水平推断蛋白质表达具有明显局限性。
纽约西奈山伊坎医学院的免疫学家 Adeeb Rahman 指出："常规测序技术可能遗漏的信息令人惊叹。"Rahman 正致力于开发新方法以监测疾病相关分子特征，并探索新型生物标志物与药物靶点。他解释道："在某些情形下，一些细胞类群显著表达特定蛋白，但我们可能仅在其中 5%-10% 的细胞中检测到相应转录本。"
Rahman 团队采用 CITE-seq（转录组和表位细胞索引测序）与 REAP-seq（RNA 表达和蛋白质测序分析）等技术，探究 RNA 转录本与蛋白质的关联，鉴定疾病相关的新细胞类型及状态。这两种技术均将抗体 - 寡核苷酸与单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）结合，实现单个细胞内基因与细胞表面蛋白表达水平的同步测定。
CITE-seq 与 REAP-seq 的核心优势在于：若存在合适抗体，即便 RNA 丰度极低，仍可检测到目标蛋白。Rahman 强调："CITE-seq 让我们对特定细胞类型中目标标记的存在更具信心。"
数十年来，研究人员借助流式细胞术检测单细胞蛋白，并通过蛋白表达模式表征细胞类型。该技术依赖检测目标蛋白的抗体，这意味着研究人员需预先明确检测靶点才能获取有效信息。
近年来，单细胞测序已成为通过基因表达模式鉴定细胞类型及状态的核心技术。其显著优势在于无偏性 —— 无需预先知晓细胞类型的 RNA/DNA 特征，仅凭测序即可获得基因组或转录组图谱。这一技术进步推动了人类细胞图谱计划等大型项目的开展，该计划致力于绘制人体 37 万亿个细胞的完整参考图谱。
如今，CITE-seq 与 REAP-seq 技术通过同步提供蛋白质和 RNA 表达的精细数据，成功填补了流式细胞术和单细胞 RNA-seq 的技术空白。哥伦比亚大学精准医学计划及纽约基因组中心负责人、著名生物化学家 Tom Maniatis 指出："多模式单细胞测序技术的突破，为解析疾病生物学机制创造了前所未有的机遇。" 将单细胞 DNA/RNA 测序与能够揭示基因表达调控、蛋白质丰度、基因突变、细胞谱系乃至分子事件时空顺序的技术相结合，不仅能构建更精确的人类细胞图谱，还能为癌症进化、神经退行性病变及免疫系统疾病应答机制提供全新洞见。
【多模式单细胞测序的实际应用】
在 CITE-seq 和 REAP-seq 技术中，细胞需与标记寡核苷酸条形码的细胞表面抗体共同孵育，同时结合作为 RNA 测序起始点的腺嘌呤碱基序列（图 1）。两种技术的差异主要体现在 DNA 条形码与抗体的连接方式上，但均具备与流式细胞术相当的蛋白质检测效能。
为验证 CITE-seq 技术的可靠性，纽约基因组中心与纽约大学 Lagone 健康中心的研究团队同步分析了人类和小鼠免疫细胞的转录组及 13 种细胞表面蛋白。结果显示，该技术不仅能准确识别不同免疫细胞类群，还可精细表征已知细胞亚型。例如，通过 CITE-seq 可发现疾病状态下天然杀伤细胞亚群在免疫应答调控中的功能差异，而单纯单细胞 RNA-seq 技术无法捕捉此类差异。
REAP-seq 技术首次应用于解析 T 细胞亚群对药物的应答机制。该药物通过靶向细胞表面蛋白激活免疫系统，进而杀伤小鼠癌细胞。对比给药与未给药组的蛋白和基因表达差异，为阐释药物作用机制提供了新视角。
目前已有 200 余种寡核苷酸偶联抗体应用于 CITE-seq 和 REAP-seq 技术。这些抗体已被用于评估晚期肺癌患者免疫治疗后的免疫细胞活化状态，以及探究临床脑血管疾病相关动脉粥样硬化部位的免疫失调机制。当 Rahman 团队利用 CITE-seq 分析脑卒中患者动脉粥样硬化病变中的免疫细胞时，发现该部位免疫细胞的活化、分化及耗竭程度显著高于血液中的 T 细胞亚群。借助此类技术表征免疫细胞特征，或为设计个性化疗法及预测患者治疗反应提供重要依据 。
【扩展多模式测序工具箱】
纽约基因组中心的 Peter Smibert 与 Neville Sanjana 基于 DNA 条形码技术原理，对 CITE-seq 进行技术升级，开发出 ECCITE-seq（通过测序扩展 CRISPR 兼容的转录组和抗原表位细胞索引）技术，实现单细胞水平转录组、蛋白质、克隆型及 CRISPR 扰动的同步检测 。
耶鲁医学院分子病毒学家 Ya-Chi Ho 在 HIV 持续性感染研究中高度评价该技术：“外周血中 HIV 感染细胞占比不足 1%，且缺乏特异性标志物区分感染与未感染 T 细胞，传统方法难以检测分析。”ECCITE-seq 通过识别 T 细胞受体 5' 端序列差异（传统 scRNA-seq 聚焦 3' 端分析难以捕获），精准定位抗原特异性克隆型，同时可同步检测细胞内 HIV RNA。“这项技术完美解决了感染细胞异质性、稀有性及标记缺失问题。”
Ho 团队正通过 ECCITE-seq 解析 HIV 感染者病毒血症期及抗逆转录病毒治疗后的血液细胞，探究感染细胞持续分裂引发的克隆扩增机制。明确抗性克隆特征将为靶向清除 HIV 储库细胞、开发治愈性疗法提供关键线索。
分子神经科学家 Abbas Rizvi 与哥伦比亚大学 Maniatis 团队合作，整合多种单细胞测序技术构建人类脊髓细胞图谱。他们借助 RNA-seq 与 ATAC-seq（染色质转座酶可及性测序）技术，在死后脊髓细胞核中鉴定活性转录调控元件，为脊髓疾病与损伤的新疗法开发提供靶点。
Rizvi 联合生物信息学家与统计学家开发数学模型整合多维数据："多模态策略能将同一细胞类型的不同测量指标关联分析，从而破译神经回路发育、建立及维持的关键分子事件。" 研究团队比较脊髓颈、胸、腰段细胞的转录模式时，发现了显著区域差异。Maniatis 表示："我们计划对肌萎缩侧索硬化症患者的脊髓进行同类分析，以解析运动神经元退化的潜在机制并筛选治疗新靶点。"
计算工具在挖掘新型测序数据的生物学意义中至关重要。Rizvi 指出，这些工具正推动单细胞技术进入 "第二波发展热潮"。Maniatis 补充道："如今我们得以以前所未有的精度解析神经退行性疾病的复杂性，及多基因与遗传变异对病程的贡献。"
【展望】
对细胞成分进行条形码编码，可让研究人员从单细胞中获取多重信息，相较于仅依赖转录组测量数据，能更精细地表征细胞表型。这些多组学信息在推动转化基因组科学与精准医学发展方面极具潜力。
Rizvi 表示：“我们对空间转录组学方法的发展充满期待，该方法可将单细胞 RNA 测序数据与解剖学背景结合。” 这有助于识别易发生神经元变性的细胞，并确定其周围可能影响疾病进程的细胞特征。
目前，单细胞多组学技术主要用于识别不同数据类别间的相关性，但随着与实验扰动技术的结合，有望快速实现因果关系的解析。
通过测序检测蛋白质需要大量预先优化的抗体。就 CITE-seq 检测细胞外蛋白的抗体而言，其数量似乎不受技术限制。而温和的细胞透化方法可使抗体进入细胞，未来或能实现细胞内蛋白的测序分析。Maniatis 指出：“此类改进将大幅提升该方法在其他系统中的功能性与适用性。”
随着 CITE-seq 和 ECCITE-seq 抗体的逐渐普及，Rahman 预计这些技术将迅速推广：“若已开展单细胞 RNA-seq，结合 CITE-seq 只需较低投入，即可获取更丰富的数据。”
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