免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）作为现代实验室的基础免疫测定方法，正通过抗原 - 抗体的特异性结合机制，在蛋白质定位、疾病诊断与机制研究中发挥关键作用。该技术融合免疫学与生物化学原理，借助标记抗体对组织切片中的目标抗原进行靶向识别，最终通过可见染色剂实现抗原 - 抗体反应的可视化呈现。

实验前准备

• 固定处理：将新鲜解剖且厚度小于 3mm 的组织，置于 2% 多聚甲醛溶液中进行固定。固定时间可根据需求选择，1 小时适用于快速处理，过夜固定则能获得更充分的固定效果，此过程需在室温环境下完成。固定结束后，用流动的自来水对组织冲洗 5 分钟，去除残留的多聚甲醛。​
• 脱水流程：依次使用 70％、80％、95％的酒精对组织进行脱水处理，每次浸泡 5 分钟。随后，用 100％的酒精进行 3 次脱水，每次同样保持 5 分钟，确保组织中的水分被充分置换。​
• 透明与浸蜡：使用二甲苯对组织进行透明化处理，清洗 2 次，每次 5 分钟。接着，将组织浸泡在石蜡中，重复 3 次，每次 5 分钟，使石蜡充分渗透到组织内部。​
• 包埋与切片：将浸蜡后的组织包埋于石蜡块中，石蜡块在室温下可长期保存。使用切片机将石蜡包埋的组织块切成 5-8μm 厚度的薄片，切片完成后，将其漂浮在 40°C 的蒸馏水中，以便后续转移操作。​
• 载玻片处理：将漂浮在蒸馏水中的切片转移至适用于免疫组织化学实验的载玻片上，完成切片放置后，将载玻片在 65℃环境下烘干 6 小时，确保切片与载玻片牢固贴合，为后续免疫组化染色步骤做好准备。​

上午

2、脱蜡与水化​

将载玻片依次浸入二甲苯溶液中进行 2 次脱蜡处理，每次浸泡 10 分钟，彻底去除石蜡成分。随后，将载玻片转移至无水乙醇中清洗 2 次，每次 5 分钟，进一步清除残留的二甲苯。接着，依次将载玻片通过 95％、85％的酒精溶液，每次浸泡 3 分钟，完成梯度水化，使组织恢复到适合后续染色的状态。最后，用自来水冲洗玻片 2 次，彻底洗去残留酒精。

 ​

3、抗原修复​

抗原修复是免疫组化实验的关键步骤，主要通过碱性或酸性修复液暴露被遮蔽的抗原表位，常用方法及修复液配方如下：​

• 碱性 Tris-EDTA 修复液（pH 8.0）：称取 Tris Base 1.21g、EDTA 0.37g，加超纯水定容至 1L，用 HCl 调节 pH 至 8.0。此修复液为常规首选方案。​

• 酸性柠檬酸缓冲液（pH 6.0）：称取柠檬酸钠 3g、柠檬酸 0.4g，加超纯水定容至 1L，适用于碱性修复效果不佳时的替代方案。​

具体操作：将 300ml 抗原修复液倒入染色容器，先用微波加热 15 分钟，待修复液充分预热后，放入载玻片，中火微波处理 15 分钟。处理结束后，让修复液自然冷却至室温（约 1 小时），可放置于冰袋附近辅助降温，但需避免温度骤降导致载玻片破裂。

下午​

4、阻断​

使用免疫组化笔围绕待染色组织边缘勾画封闭圈，有效减少试剂用量。随后，在组织区域滴加 3% H₂O₂溶液，室温孵育 12 分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。孵育结束后，用自来水冲洗载玻片，并将其暂时浸泡于 PBS 缓冲液中，防止组织干燥。

​

5、封闭​

配制 5% 羊血清封闭液（以超纯水稀释），将封闭液均匀覆盖在组织切片上，于 37℃恒温孵育 30 分钟，以封闭非特异性蛋白结合位点。孵育完成后，倾去封闭液，无需水洗直接进入下一步。

​

6、抗体孵育​

• 一抗孵育：将 100μl 经适当稀释的一抗（稀释于含 0.5％BSA 的 PBS 缓冲液中）均匀滴加至组织切片表面，37℃孵育 1 小时，使一抗特异性结合目标抗原。孵育结束后，用 PBST（PBS+1% 吐温 20）缓冲液冲洗切片 3 次，每次 5 分钟，洗去未结合的一抗。​

• 二抗孵育：每片载玻片滴加 2 滴二抗，37℃孵育 30 分钟，通过二抗与一抗的特异性结合放大检测信号。孵育后同样用 PBST 缓冲液冲洗 3 次。若使用生物素标记的二抗，需额外增加一步：滴加链霉亲和素偶联的 HRP 复合物，37℃孵育 15 分钟，再进行 PBST 冲洗。​

7、显色（DAB 法）​

按 50μl 色原（A 液）与 1ml 底物（B 液）的比例现配 DAB 显色液，混合后立即使用（7 分钟内有效）。将显色液滴加至切片，实时观察组织显色情况，当目标区域出现明显棕色沉淀时，迅速用 PBS 缓冲液终止反应，随后用自来水冲洗 3 次。若 7 分钟后仍无显色，则表明该组织无阳性表达，需终止反应并进行后续处理。

​

8、复染​

使用前需先去除苏木素染液表面的氧化膜，将载玻片浸入苏木素染液中染色 90 秒，以复染细胞核。染色后用自来水冲洗 3 次，洗去多余染液。

​

9、分化​

将载玻片浸入 75% 乙醇与 1% HCl 的混合液中分化 1 秒，通过调节 pH 值增强细胞膜与细胞质的染色对比度。分化后立即用自来水冲洗 3 次，终止分化反应。

​

10、脱水与透明​

依次将载玻片浸入 85％、95％、100％、100％酒精溶液中脱水，每次 2 分钟，彻底去除组织中的水分。脱水后使用冷风吹干载玻片，随后将其浸入二甲苯溶液中透明处理 10 分钟，使组织达到光学透明状态。

​

11、封片​

根据实验需求选择合适的封片剂：水性封片剂适用于常规观察；荧光水性封片剂用于荧光标记样本；通用型封片剂适用于多种样本类型。使用中性树脂封片或封片机进行封片操作，完成实验制片流程。​

上述内容系统梳理了免疫组化实验步骤。

 

LabEx免疫组化服务

 

---

 

乐备实是国内专注于提供高质量蛋白检测以及组学分析服务的实验服务专家，自2018年成立以来，乐备实不断寻求突破，公司的服务技术平台已扩展到单细胞测序、空间多组学、流式检测、超敏电化学发光、Luminex多因子检测、抗体芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、多色免疫组化等30多个，建立起了一套涵盖基因、蛋白、细胞以及组织水平实验的完整检测体系。

我们可提供从样本运输、储存管理、样本制备、样本检测到检测数据分析的全流程服务。凭借严格的实验室管理流程、标准化实验室操作、原始数据储存体系以及实验项目管理系统，已经为超过3000家客户单位提供服务，年检测样本超过100万，受到了广大客户的信任与支持。