细胞免疫荧光技术（点击查看更多）作为解析蛋白质功能的关键手段，能够精准定位细胞内蛋白质的分布，并实时追踪特殊信号分子在细胞核内外的动态转位，为揭示肿瘤发生发展机制提供直观证据。在实验操作中，细胞爬片是不可或缺的载体，需将其无菌放置于细胞培养皿内的培养基中，待细胞在爬片表面完成贴壁生长并达到合适密度后，方可开展后续的免疫荧光染色流程，确保实验结果的准确性与可靠性。
- 消化试剂：含 EDTA 的 0.25% 胰蛋白酶溶液（-20℃分装冻存，使用前 37℃水浴预热）
- 培养基：高糖型 DMEM 完全培养基（添加 10% 胎牛血清、1% 双抗，4℃避光保存）
- 培养耗材：无菌 6 孔板或 12 孔细胞培养板（推荐低吸附表面处理款）
- 实验载体：灭菌圆形 / 方形玻璃细胞爬片（直径 12mm 或 22mm，提前紫外照射 30 分钟）
- 当细胞汇合度达到 90%-95% 时，弃去旧培养基，用预热的 PBS 轻柔漂洗细胞 2 次。加入适量预热胰酶（6 孔板每孔 0.5ml，12 孔板每孔 0.25ml），37℃孵育 1-2 分钟。在显微镜下观察，待细胞变圆后，立即加入等体积完全培养基终止消化。用 1ml 移液枪轻柔吹打培养皿底部，确保细胞完全脱离皿壁，形成均匀单细胞悬液，采用血球计数板进行细胞计数。
- 爬片预处理与细胞接种：取无菌 12 孔细胞培养板，使用 200μl 移液器在各孔中央拟放置爬片区域滴加 3-5 滴（约 150-200μl）预热的 DMEM 完全培养基。镊子经 75% 乙醇消毒后，夹取灭菌玻璃爬片，轻置于培养基液滴中央，确保爬片完全贴合孔底。随后用移液枪头轻压爬片边缘，利用培养基表面张力使爬片与孔底紧密贴合，避免后续加样时爬片漂浮导致细胞双层生长。根据实验设计（如细胞增殖速率、蛋白表达丰度），调整细胞悬液浓度，按适宜密度（如每孔 5×10⁴-1×10⁵个细胞）接种至各孔，轻柔晃动培养板使细胞均匀分布，置于 37℃、5% CO₂培养箱中继续培养。
- 根据细胞系的增殖特性（如 HeLa 细胞约 24h 倍增，原代细胞可能需 48-72h），在接种后 24-48h 通过倒置显微镜动态评估细胞密度。当细胞达到85%-95% 汇合度（即视野中细胞单层覆盖率达此范围）且形态保持饱满状态时，终止培养进行后续实验。
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轻柔洗涤：弃去培养基，每孔加入 1mL 预冷的 1×PBS（含 0.1% NaN₃），水平晃动培养板 5 次 / 次，重复 3 次，彻底清除血清蛋白。
注意：避免直接冲洗爬片表面，防止细胞脱落。
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多聚甲醛固定：
- 现配 4% 多聚甲醛（PBS 配制，pH 7.4），每孔加入 1mL，室温避光固定 20min。
- 固定机制：通过醛基交联蛋白，保留抗原表位和亚细胞结构。
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清洗残留固定剂：
- 用含 0.1% Tween-20 的 PBS（PBST）洗涤 3 次，每次 5min，振荡速度≤50rpm。
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细胞膜通透化：
- 加入 0.5% Triton X-100（PBST 配制），室温孵育 20min。
- 作用：破坏脂质双分子层，允许抗体进入胞内。
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封闭非特异性位点：
- 选择与二抗同源的封闭液：
- 10% 山羊血清（适用于抗小鼠 / 兔二抗）
- 5% BSA（无血清体系）
- 每孔加入 200μL，37℃孵育 2h，无需清洗直接进行下一步。
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一抗孵育：
- 按抗体说明书推荐浓度用封闭液稀释一抗。
- 每孔加入 100μL，4℃湿盒内避光孵育 16-18h（避免反复冻融抗体）。
- 优化技巧：
- 首次使用新抗体需进行梯度稀释验证（如 1:100、1:500、1:1000）
- 肿瘤组织样本建议增设同型对照。
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清洗未结合一抗：
- PBST 洗涤 3 次，每次 5min，轻拍培养板边缘确保充分清洗。
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二抗孵育：
- 避光操作！用封闭液稀释荧光二抗。
- 每孔加入 100μL，37℃避光孵育 1h（铝箔包裹培养板）。
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二抗清洗：
- PBST 避光洗涤 3 次，每次 5min，最后一次用无 Tween 的 PBS 漂洗。
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DAPI 复染：
- 用 PBS 稀释 DAPI 至 1μg/mL，每孔加入 100μL，避光孵育 5-8min。
- 注意：DAPI 有毒性，需戴手套操作。
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封片与保存：
- 用镊子取出爬片，吸水纸轻触边缘吸干水分。
- 滴加含抗淬灭剂的封片剂，将爬片细胞面朝下覆盖在载玻片上，避免气泡。
- 4℃避光保存，建议 24h 内完成成像。
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DAPI 漂洗：每孔加入 1ml PBS 缓冲液，轻柔晃动培养板，室温下漂洗细胞 3 次，每次 5 分钟，彻底清除未结合的 DAPI，减少背景荧光干扰。
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爬片取出技巧：为避免损伤细胞，使用前将注射器针头弯成微型钩状（针尖朝背侧弯曲约 30°）。操作时，将弯钩小心插入爬片边缘与孔底的缝隙，利用杠杆原理轻柔上挑，待爬片松动后，迅速用灭菌镊子夹持取出，确保细胞形态完整。
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封片与成像：用无菌吸水纸吸去爬片表面多余液体，在多聚赖氨酸载玻片中央滴加适量含抗荧光淬灭剂的封片液。将爬片细胞面倒置贴合于封片液上，轻压排出气泡，避免产生折光伪影。置于荧光显微镜下，根据一抗所偶联荧光基团的激发 / 发射波长参数，选择对应滤光片组进行观察。
（1）爬片操作规范：使用经灭菌处理的镊子夹取细胞爬片时，需采用「两点夹持法」，即镊子尖端轻触爬片两侧边缘，避免直接施压于中央细胞区域。若爬片与孔底粘连紧密，可先用 PBS 浸润边缘辅助分离，防止因蛮力操作导致玻片碎裂或细胞层损伤，影响后续成像分析。
（2）细胞接种优化：制备单细胞悬液后，建议采用「涡旋振荡 + 移液枪吹打」双重混匀法，确保细胞浓度均一。接种至培养板后，通过「十字交叉平移法」水平晃动培养板，使细胞均匀分布，避免因局部密度过高引发接触抑制，干扰蛋白表达检测。
（3）荧光保护策略：涉及荧光二抗的操作全程需在避光环境下进行，推荐使用铝箔包裹反应板或在暗箱内操作。洗涤步骤采用「轻柔倾倒 + 沿孔壁缓慢添加」的 PBS 冲洗方式，减少荧光淬灭风险，同时避免强光照环境对荧光信号的不可逆损伤。
（4）成像时效管理：免疫荧光染色完成后，应在 2 小时内完成成像采集。若需延迟观察，需将封片后的样本置于含干燥剂的避光暗盒，4℃低温保存，且最长保存时间不超过 24 小时，防止荧光信号因淬灭或背景升高影响数据质量。
（5）显微镜参数设置：根据荧光基团特性（如 FITC/AF488 使用 488nm 激发光，Cy3/AF555 使用 555nm 激发光）精准选择滤光片组与光源。需注意，PI 染料可同时标记死细胞（红色）和活细胞（弱红色），而 DAPI 可将所有细胞核染为蓝色；仅在凋亡细胞中，FITC-12-dUTP 会特异性掺入断裂 DNA 链，呈现绿色荧光，需据此设置多通道成像参数以区分不同细胞状态。
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实验前准备
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