这次的文章选自《Molecular Cell》杂志的“A Peptide Encoded by a Putative lncRNA HOXB-AS3Suppresses Colon Cancer Growth”一文。

HOXB-AS3 lncRNA水平在高度转移性癌细胞和原发性癌症中降低
通过RNA测序研究RNA表达差异，癌细胞中LncRNA HOXB-AS3水平较正常细胞降低。然而，HOXB-AS3的功能尚不清楚。作者进一步证实，与亲本细胞系相比，高转移性结肠(SW620和HTC-116high)、乳腺(MDA-MB-231high)、鼻咽癌(S18)和卵巢(SK-OV-3high和OVCAR-3high)癌细胞亚群中HOXB-AS3 RNA水平降低(图S1A和S1B)。
接下来，作者研究了六对匹配的新鲜冷冻初级CRC组织及其对应的相邻非肿瘤（NT）结肠组织中HOXB-AS3 RNA的水平。与它们相应的NT组织中的HOXB-AS3 RNA水平相比，这些原发性CRC组织中的HOXB-AS3 RNA水平也被下调（图1A）。

lncRNA HOXB-AS3编码一个小肽
HOXB-AS3最初被注释为人的一个lncRNA基因(nr_0332010.2)。然而，核糖体分析显示HOXB-AS3 RNA与核糖体结合，这表明HOXB-AS3可能编码蛋白质或小肽。作者进一步在包括人类在内的灵长类动物中发现了一个短的159-nt的小ORF，该ORF可能编码高度保守的53-aa肽(图1B)，但在任何其他物种中都没有发现与人类159-nt的ORF序列编码HOXB-AS3肽的同源核苷酸序列(数据未显示)。序列比较没有发现与其他任何蛋白和经典结构域/基序的同源性，这增加了lncRNA HOXB-AS3编码未鉴定小肽的可能性。
为了研究HOXB-AS3 ORF的起始密码子是否具有活性，通过将一个GFPmut ORF(起始密码子ATGGTG突变为ATTGTT)融合到ORF的C端和全长HOXB-AS3转录本中的5 ' UTR-ORF中，产生了一系列的结构体（图1C）。在转染了HOXB-AS3 ORF-GFPmut和5'UTR-OFR-GFPmut的细胞中观察到HOXB-AS3-GFP融合蛋白的大量表达（图1D）。但是，HOXB-AS3-GFP融合蛋白的表达消除了HOXB-AS3 ORF起始密码子从ATG到ATT的突变（5'UTR-ORFmut-GFPmut）（图1D）。使用抗GFP抗体进行的蛋白质印迹分析进一步证实，HOXB-AS3-GFP融合蛋白在HOXB-AS3 ORF-GFPmut-和5'UTR-ORF-GFPmut转染的细胞中展现出预测的相对分子质量，而在HOXB- AS3 5'UTR-ORFmut-GFPmut转染的细胞（图1E）。
GFP标签的尺寸大于小的HOXB-AS3肽。在许多研究中，带有GFP标签的蛋白会改变该蛋白的特定表型。因此，这里产生了一系列构建体，其中Flag标签（六个氨基酸）与全长HOXB-AS3转录物中的ORF或5'UTR-ORF的C末端融合（图1G） 。在HOXB-AS3 ORF-Flag-和5'UTR-OFR-Flag转染的细胞中观察到HOXB-AS3-Flag融合蛋白的大量表达（图1H-I）。但是，HOXB-AS3- ORF起始密码子从ATG突变为ATT（5'UTR-OFRmut-Flag）消除了HOXB-AS3-Flag融合蛋白的表达（图1H-I）。这些结果与使用HOXB-AS3-GFP融合蛋白发现的结果相似。因此，Flag标签融合构建体被用于随后的实验中。
为了检测HOXB-AS3 ORF在细胞中编码的肽，作者生产了针对HOXB-AS3肽的抗体。使用抗HOXB-AS3抗体在HOXB-AS3 ORF-Flag-和5'UTR-OFR-Flag转染的细胞中检测到HOXB-AS3-Flag融合蛋白，但HOXB-AS3 ORF起始密码子发生了突变（5’UTR-OFRmut-Flag）取消了HOXB-AS3-Flag融合蛋白的检测（图1I-J）。对于HOXB-AS3-GFP融合蛋白也观察到相似的结果（图1E-F）。综上所述，这些数据表明HOXB-AS3融合蛋白在细胞中表达。

图1

HOXB-AS3肽是天然，内源性产生的
为了检测HOXB-AS3 ORF编码的细胞中天然产生的内源性肽，使用抗HOXB-AS3抗体检测了细胞HOXB-AS3肽。验证了HOXB-AS3肽在CRC SW620和SW480细胞中的存在（图2 A），并且证实了HOXB-AS3肽是结肠，乳腺癌，卵巢和鼻咽癌细胞中天然，内源性产生的（图2 B），表明HOXB-AS3肽在各种组织中广泛表达。为了排除内源性产生的HOXB-AS3肽不是由其他更长的蛋白质加工而成，可使用抗HOXB-AS3的翻译阻断反义寡核苷酸来阻断HOXB-AS3肽的翻译。如图2C所示，抗HOXB-AS3翻译阻断反义寡核苷酸完全阻断了HOXB-AS3肽的表达。

图2

HOXB-AS3肽水平低表明CRC患者的预后不良
为了检查HOXB-AS3肽在CRC癌变中的作用，分析了六对匹配的新鲜原发CRC组织和相应的NT组织以及具有不同转移水平的癌细胞亚系中HOXB-AS3肽的水平。与它们的亲代细胞系相比，HOXB-AS3肽水平在高度转移的结肠，乳腺，鼻咽和卵巢癌细胞亚系中也被下调（图3B）。与相应的NT组织相比，初级CRC组织中的HOXB-AS3肽水平与HOXB-AS3 RNA水平相似（图3D）。
此外，使用IHC对90对匹配的CRC和相应的NT组织样品进行了广泛的组织微阵列分析（图3 E）。与NT组织相比，CRC组织中检测到的HOXB-AS3肽水平降低（图3F）。HOXB-AS3肽水平降低与CRC的更高级临床分期呈正相关（p = 0.037）。Kaplan-Meier生存分析表明，与HOXB-AS3表达水平较高的患者相比，HOXB-AS3肽水平较低的患者患CRC相关死亡的风险增加（图3 G-H；p＜0.0001） 。患有HOXB-AS3的CRC患者的平均总生存时间低为46.0个月，而HOXB-AS3高的CRC患者为75.0个月。因此，降低的HOXB-AS3肽水平与CRC患者的不良预后相关。

HOXB-AS3肽而非HOXB-AS3 lncRNA抑制CRC的生长
为了研究HOXB-AS3肽和lncRNA对癌症进展的影响，将全部包含Flag标签的HOXB-AS3 ORF，5'UTR-ORF和5'UTR-ORFmut构建体转染到低HOXB的CRC细胞中-AS3表达式。均表达HOXB-AS3肽的HOXB-AS3 ORF和5'UTR-ORF构建体均抑制癌细胞集落的形成，生长，迁移和侵袭（图3A-C）。相反，5'UTR-ORFmut包含突变的HOXB-AS3起始密码子，因此不编码HOXB-AS3肽，不会改变CRC细胞的生长，集落形成，迁移或侵袭（图3 A-C ）。
更重要的是，如图3 D所示，由HOXB-AS3 ORF和5'UTR-ORF稳定转染的细胞组成的CRC异种移植的体内生长明显受到损害。然而，HOXB-AS3 5'UTR-ORFmut的异位稳定表达并未显着改变CRC异种移植肿瘤的生长。此外，尾静脉注射荧光素标记的HOXB-AS3 ORF或5 UTR-ORF稳定表达的HTC-116细胞后，小鼠肺中出现了较小的转移性结节，但在HOXB-AS3 5 UTR-ORFmut稳定表达的HTC-116细胞中则没有(图3E)。通过组织学分析进一步证实了肺转移性结节（图3F）。这些数据提供了直接的证据，表明HOXB-AS3基因的肽产物而不是其lncRNA在体外抑制癌细胞的生长，菌落形成，迁移和侵袭以及体内的肿瘤发生。总体而言，这些数据表明HOXB-AS3编码了一种小肽，起着抑癌作用。

HOXB-AS3肽与hnRNP A1蛋白相互作用
HOXB-AS3肽是未表征的小肽，与其他蛋白质缺乏同源性。为了进一步研究HOXB-AS3肽在癌症进展中的作用机制，鉴定了与HOXB-AS3肽相互作用的蛋白质（图4 A）。
为了表征这些HOXB-AS3相互作用蛋白的功能作用，使用生物信息学对它们的生物学过程和蛋白-蛋白相互作用网络进行了分析。蛋白质-蛋白质相互作用测定与基因本体论（GO）注释测定结合显示，与HOXB-AS3肽相互作用的大多数蛋白质都参与RNA剪接（图4 B），这表明HOXB-AS3肽可能会调节细胞RNA剪接。
作者进一步证实了在存在或不存在RNase A处理的情况下HOXB-AS3与hnRNP A1之间的相互作用（图4 C-D），表明HOXB-AS3与hnRNP A1的相互作用与RNA无关。
HnRNP A1由两个RNA识别基序（RRM1和RRM2），一个与RNA结合的RGG框（RGG）和一个核靶向序列（M9）组成。为了研究哪些域与HOXB-AS3肽相互作用，作者生成了带有C端HA标签的hnRNP A1截短的构建体，并在HOK293T细胞中与HOXB-AS3-Flag共表达（图4 E）。只有含有RGG框结构域的构建体，而不包含hnRNP A1的其他区域，才能保留与HOXB-AS3肽相互作用的能力，这表明hnRNP A1的RGG框对于HOXB-AS3结合是必不可少的（图4 F-G） 。 作者发现HOXB-AS3肽结合了宽型的hnRNP A1，但未结合hnRNP A1 AGG突变体（图4H-J），表明RGG基序中精氨酸残基的突变破坏了hnRNP A1与HOXB-AS3的相互作用。肽和RGG基序中的精氨酸残基对于HOXB-AS3结合至关重要。

图4

本文涉及技术： 流式细胞术

本文涉及技术： 多重免疫组化

 

本文涉及技术： 单/多因子检测