基因芯片（又称 DNA 芯片、生物芯片）作为高通量基因表达分析的核心工具，其测序原理基于核酸分子杂交技术，通过与已知序列的核酸探针杂交实现靶核酸序列的测定与定量分析。在芯片基片表面固定着大量序列已知的靶核苷酸探针，当溶液中带有荧光标记的待测核酸序列（如 TATGCAATCTAG）与芯片上对应位置的探针发生互补匹配时，通过检测荧光强度最强的探针位置，可重组出靶核酸的完整序列，进而实现基因表达水平的高通量检测。
自 20 世纪 80 年代中期原型提出以来，基因芯片技术不断发展，形成了以 Affymetrix、Illumina 和 Agilent 为代表的主流技术平台。不同平台虽在探针合成、芯片结构和检测流程上存在差异，但均以杂交信号强度作为基因表达量的量化依据，其数据解读的核心在于理解探针设计逻辑、信号产生机制及平台特异性对结果的影响，为后续数据分析与生物学解读奠定基础。
Affymetrix 公司凭借专利的寡核苷酸原位光刻合成技术，成为基因芯片领域的领军者。该技术通过在碱基单体 5' 羟基末端连接光敏保护基，以光控合成的方式在基片上精准构建高密度探针阵列。合成过程中，通过特定图案的蔽光膜控制光照区域，使受光部位的羟基脱保护活化，与携带光敏保护基的单体发生偶联反应。每次合成循环中，通过更换蔽光膜和单体类型，可按预设序列延伸寡核苷酸链。
这种技术的优势在于合成效率呈指数增长，例如合成 8 个碱基的寡核苷酸（理论上有 65,536 种排列）仅需 32 个化学步骤，8 小时即可完成，能在芯片上形成高达 500,000 个探针的高密度阵列，为高分辨率基因表达分析提供了基础。探针的高密度分布和序列特异性确保了检测的高灵敏度与低假阳性率，是其数据可靠性的核心保障。
Affymetrix 表达谱芯片分为传统的 “In Vitro Transcription”（IVT）芯片和新一代的 “Whole Transcriptome”（WT）芯片，两者在 cDNA 合成策略上的差异直接影响数据特征：
IVT 芯片：采用 Oligo dT 引物和 T7 逆转录酶合成 cDNA，所得 cDNA 主要集中在 mRNA 的 3' 末端区域。这一特征使其对 3' 端完整的 mRNA 检测效率高，但可能遗漏转录本中部或 5' 端的序列变异，数据解读时需注意其对转录本覆盖的局限性。
WT 芯片：使用随机引物结合 T7 逆转录酶，cDNA 覆盖范围扩展至转录本的更多区域。这种设计使其在数据解读中具有显著优势：能更全面反映转录本表达水平，增强结果代表性；可针对差异剪接形成的不同转录本设计特异性探针，准确区分异构体表达变化；还能有效检测长链非编码 RNA（lncRNA），扩展了数据解读的生物学范围。典型的 WT 芯片如 HTA 2.0、Exon 1.0 等，已成为复杂转录组分析的主流选择。
Illumina 的 “Infinium” 芯片（曾用名 “Bead Array”）采用独特的微珠阵列设计，基片内表面通过光蚀刻加工出整齐排列的微米级小孔，每个小孔恰好容纳一颗微珠。微珠表面偶联有数十万个相同序列的 DNA 片段，这些片段由 “Address 序列” 和 “Probe 序列” 组成：Address 序列是微珠的特异性标签，用于标识探针身份；Probe 序列则作为杂交位点，与待测核酸互补结合。
芯片生产中，数十万种微珠按比例混合后随机分布于基片小孔，通过检测每个小孔中微珠的 Address 序列，可确定其对应的 Probe 序列，形成专属的 “.dmap 文件”（芯片地图）。数据解读前必须匹配该文件，才能将荧光信号与具体基因探针关联，这是 Illumina 数据处理的关键步骤。
Illumina 芯片的样本制备与 Affymetrix 类似，需生成带标记的 cRNA 与探针杂交。标记方式主要有两种：生物素标记（如 Human HT-12 V4 芯片）通过荧光标记的抗生物素蛋白结合检测信号；直接荧光标记（如 Human Whole Genome DASL HT 芯片）则适用于石蜡包埋（FFPE）等特殊样本。
数据解读中，荧光强度直接反映目标 RNA 的表达水平 —— 表达量越高的 RNA 与探针杂交的概率越大，荧光信号越强。芯片上每个探针由平均 15 颗以上的微珠重复代表，通过计算重复微珠的信号平均值可降低技术误差，提高数据可靠性。解读时需关注局部背景信号（如黄色像素区域）与阳性信号（红色像素区域）的比值，确保信号的统计学显著性。
Agilent 芯片采用类似喷墨打印的技术合成探针，以玻璃片为基片，通过专用墨盒将携带保护基团的 A/C/G/T 四种碱基底物按预设序列精准喷印到基片表面。合成过程包括偶联、氧化和去保护三个步骤：碱基喷印后发生偶联反应延长 DNA 链，经氧化将亚磷酸基团转化为稳定的磷酸基团，再去除 5' 位羟基的 DMT 保护基团，为下一轮延伸做准备。
该技术合成效率高达 99% 以上，可制备最长 300 个碱基的探针，长探针设计增强了与靶序列的结合特异性，降低了非特异性杂交对数据的干扰，使数据解读更聚焦于真实的基因表达变化。
Agilent 表达谱芯片基于 3' IVT 原理，样本处理中通过 T7 启动子介导的体外转录生成带标记的 cRNA。其检测系统分为单色和双色两种：
单色芯片：仅对实验组样本进行荧光标记（如 Cy5），通过绝对荧光强度量化基因表达量，数据解读需结合芯片内参校正背景信号。
双色芯片：实验组用 Cy5 标记，参照组用 Cy3 标记，两者共杂交后通过 Cy5/Cy3 的荧光强度比值反映表达差异。这种设计可有效减少芯片间变异，数据解读中直接以比值作为差异表达的核心指标，适用于两组样本的对比分析。
无论采用何种平台，基因芯片数据解读均需围绕探针设计逻辑、信号产生机制和技术局限性展开：需明确探针覆盖范围对转录本检测的影响（如 IVT 芯片的 3' 端偏好）；关注重复探针的信号一致性以评估数据可靠性；结合芯片类型选择合适的标准化方法（如单色芯片的分位数标准化、双色芯片的比值校正）；最终需通过生物学重复验证确保差异表达基因的真实性。深入理解各平台的技术原理，是准确解读基因芯片数据、挖掘生物学意义的关键前提。
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