蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPIs）是细胞信号传导、代谢调控及生理功能实现的核心分子基础，其空间动态变化直接影响细胞表型与疾病进程。精准解析 PPIs 的亚细胞定位及动态调控模式，对于阐明信号网络激活机制、揭示通路串扰规律具有重要意义。在众多检测技术中，邻近连接检测技术（PLA）凭借高灵敏度、原位分析能力及单分子分辨率等优势，已成为研究蛋白质互作的重要工具，为探索复杂生物系统中的 PPIs 提供了全新视角。
近年来，PLA 技术不断革新，衍生出顺序 PLA、环形 PLA（c-PLA）等改良方法，显著提升了检测严格性、兼容性及通量，使其在基础研究与临床转化中展现出广阔应用前景。本文将系统介绍 PLA 技术原理、衍生方法的技术优势及其在蛋白质互作研究中的核心应用，为深入理解这一技术的生物学价值提供参考。
邻近连接检测技术（PLA）是一种将抗体特异性识别与 DNA 信号放大相结合的检测方法，其核心原理基于 “邻近效应” 实现蛋白质互作的可视化与量化。技术流程主要包括：首先，采用两种针对目标蛋白质不同表位的一抗（通常来自不同物种）特异性结合分析物；随后，与一抗结合的 PLA 探针（二抗偶联的 DNA 短链）通过抗原 - 抗体相互作用靠近，当两个目标蛋白质发生相互作用（距离通常小于 20-40nm）时，PLA 探针携带的 DNA 链可在连接酶作用下形成互补双链；最后，通过滚环扩增（RCA）技术对连接后的 DNA 进行信号放大，加入荧光标记的互补寡核苷酸探针后，在荧光显微镜下可观察到代表 PPIs 的明亮荧光斑点，每个斑点对应一对相互作用的蛋白质分子。
这种设计将蛋白质互作信号转化为可检测的 DNA 扩增信号，既保留了抗体检测的特异性，又通过 DNA 扩增实现了超高灵敏度，使低丰度 PPIs 的原位检测成为可能。
PLA 技术的显著优势体现在三个方面：
超高灵敏度：通过滚环扩增实现信号级联放大，检测限可达飞摩尔至纳摩尔级别，能够捕捉生理条件下低丰度蛋白质的微弱相互作用，克服了传统免疫共沉淀技术对高丰度蛋白的依赖。
亚细胞水平空间分辨：无需破坏细胞结构，可在原位保留蛋白质的天然构象与亚细胞定位信息，精准确定 PPIs 在细胞核、细胞质、细胞器等亚结构中的分布模式，为解析信号通路的区域化调控提供直接证据。
强兼容性与多功能整合：可与免疫荧光、流式细胞术、共聚焦显微镜等技术联用，实现蛋白质定位与互作的同步分析；同时适用于细胞培养物、组织切片、临床样本等多种材料，为基础研究向临床转化搭建桥梁。
顺序邻近连接检测技术通过多轮 PLA 反应的组合应用，实现了对复杂信号网络中多重 PPIs 的系统分析。研究者利用该方法成功对表皮生长因子受体（EGFR）突变的非小细胞肺癌模型中 47 种蛋白质的相互作用进行了高通量检测，结合免疫荧光技术明确了 PPIs 在亚细胞结构中的共定位特征。
该技术能够动态追踪药物干预下 PPIs 的时空变化：在酪氨酸激酶抑制剂奥希替尼处理后，可完整重建 EGFR 通路相关 PPIs 的亚细胞分布重塑过程，揭示药物对信号网络的调控机制。基于空间分辨 PPIs 数据构建的图卷积网络，能够准确预测单细胞的药物处理状态，为通过 PPIs 模式解析细胞功能状态提供了新的分析范式，推动了靶向蛋白质互作组的药物设计研究。
环形邻近连接检测技术（c-PLA）通过优化反应设计，在检测严格性与操作便捷性上实现了突破。与传统 PLA 不同，c-PLA 中两个邻近探针结合分析物后，可引导游离寡核苷酸形成环形 DNA 分子，而非线性双链。这一环形结构设计显著降低了随机背景连接事件，通过酶促反应可高效去除未环化的 DNA，大幅提升了检测信噪比；同时，环形结构增强了抗原 - 探针复合物的稳定性，使检测结果的重现性得到改善。
c-PLA 的独特优势还体现在对低亲和力试剂的兼容性上：面对亲和力较低的抗体时，c-PLA 可通过增加探针浓度提高结合效率，同时避免背景信号升高，解决了传统 PLA 在低亲和力抗体应用中信号弱、背景高的难题。在缓冲液和人体血浆样本中，c-PLA 的灵敏度显著优于传统方法，为临床样本中 PPIs 的检测提供了更可靠的技术选择。
在肿瘤研究中，PLA 技术为解析癌蛋白互作网络提供了关键工具。在淋巴瘤模型中，PLA 可清晰检测癌蛋白 MYC 与抗凋亡蛋白 BCL-2 的相互作用，揭示二者协同促进肿瘤细胞存活的分子机制；在非小细胞肺癌中，通过分析 EGFR 突变细胞中 EGFR 与下游效应分子（如 KRAS、PI3K）的 PPIs 动态变化，可阐明酪氨酸激酶抑制剂耐药的潜在机制，为开发联合治疗策略提供依据。PLA 技术能够在临床组织样本中保留 PPIs 的空间分布信息，使患者特异性互作模式与临床预后的关联分析成为可能。
PLA 技术在药物研发中可用于验证靶点互作及评估药物干预效果。在靶向治疗研究中，通过对比药物处理前后 PPIs 的荧光斑点数量与分布变化，可直接反映抑制剂对目标互作的阻断效率。在奥希替尼处理的 EGFR 突变肺癌细胞中，PLA 可实时追踪 EGFR 二聚化水平的降低及下游信号通路 PPIs 的解体过程，为优化药物剂量、预测耐药风险提供量化指标。
在罕见病研究中，PLA 技术结合单分子成像可解析基因突变导致的蛋白质互作异常。对于因蛋白质结合域突变引发的罕见遗传病，PLA 能够在单细胞水平检测突变蛋白与野生型蛋白在互作效率、亚细胞定位上的差异，为阐明致病机制提供直接证据。在神经退行性疾病中，PLA 可用于研究异常聚集蛋白（如 tau 蛋白、α- 突触核蛋白）的互作模式，揭示疾病进展的分子基础。
PLA 技术及其衍生方法的不断创新，为蛋白质互作研究提供了更强大的工具。未来，随着高通量 PLA 技术的发展，有望实现单细胞水平上数百种 PPIs 的并行分析，推动蛋白质互作组学的精准解析；结合超分辨显微镜技术，可进一步突破光学衍射极限，在纳米尺度上揭示 PPIs 的动态组装过程。c-PLA 等改良方法在临床样本检测中的应用，将促进 PPIs 作为新型生物标志物在疾病诊断与预后评估中的转化。
作为解析蛋白质互作的核心技术，PLA 正从基础研究向临床应用快速推进，其在信号网络解析、药物研发及精准医疗中的价值将不断凸显，为深入理解生命活动规律及疾病防治提供有力支撑。
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