一、FISH 荧光共定位的技术意义

二、FISH 荧光共定位定量分析的操作步骤（以 Image Pro Plus 为例）

（一）图像导入与功能调用

1.启动 Image Pro Plus 软件，导入 FISH 实验获得的共定位图像（含目标核酸序列的红色荧光通道与绿色荧光通道）；

红色通道

绿色通道

2.点击顶部菜单栏 “Measure” 选项，在下拉列表中选择 “Co-localization” 功能模块，进入共定位分析界面。

（二）通道参数设置与散点图生成

1.针对 FISH 实验的红绿双荧光通道，在弹出的参数设置窗口中，将 “Channel 1” 指定为红色荧光通道（对应序列 A 探针），“Channel 2” 指定为绿色荧光通道（对应序列 B 探针），确认无其他通道干扰后点击 “Forward”；

2.系统自动生成 “红色 - 绿色荧光强度散点图”：横轴代表红色通道荧光强度，纵轴代表绿色荧光通道荧光强度。若散点集中分布于对角线附近，提示两种目标核酸序列的荧光信号相关性强，初步表明存在共定位趋势。

（三）定量参数计算与结果输出

1.在后续参数设置界面中，勾选 “Pearson Correlation Coefficient（皮尔逊相关系数）” 与 “Overlap Coefficient（重叠系数 R）” 计算选项，点击 “Forward”；

2.系统基于散点图数据进行线性回归分析，输出定量结果：皮尔逊相关系数反映两通道荧光信号的线性相关程度（取值范围 - 1~1，越接近 1 相关性越强），重叠系数 R 反映荧光信号的空间重叠比例（取值范围 0~1，越接近 1 重叠度越高）。例如，若输出皮尔逊相关系数为 0.919、重叠系数 R 为 0.932，表明两种目标核酸序列的共定位程度极高。

三、核心结果报告要求