一、ELISA 的核心定义与检测原理

固相包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附（疏水、静电作用）固定于聚苯乙烯微孔板（固相载体），确保包被分子均匀分布且保留天然构象，为后续结合反应提供稳定界面；

封闭处理：用 5% 脱脂牛奶或 1% BSA 等封闭液孵育，占据载体空白位点，避免游离成分非特异性吸附，降低背景信号；

样本孵育：加入含待测物质的样本（血清、细胞培养液等），37℃孵育 60 分钟左右，使目标物质与固相包被分子特异性结合，形成 “固相 - 待测物质” 复合物；

洗涤分离：用含 0.05% 吐温 - 20 的 PBS 多次洗涤，去除液相中未结合的杂蛋白、游离抗体等，仅保留固相表面的特异性复合物；

酶标显色与定量：加入酶标记二抗（如 HRP、ALP 标记），形成 “固相 - 待测物质 - 酶标二抗” 三明治结构；再加入特异性底物（TMB、pNPP 等），酶催化底物显色后，通过酶标仪检测吸光度，结合标准曲线计算待测物质浓度。

ELISA试剂盒的原理

二、ELISA 技术的发展历程：从初创到产业化

（一）初创期（20 世纪 70 年代）：方法奠基

（二）优化期（20 世纪 80-90 年代）：技术突破

单抗技术应用：杂交瘤技术诞生后，单抗以 “特异性强、均一性高” 取代多抗，如肿瘤标志物 AFP 检测的交叉反应率从 15% 降至 1% 以下；

基因工程升级：重组技术改造抗体（如 scFv、Fab 片段），提升结合效率；实现抗体 - 酶融合表达，简化酶标过程；

仪器革新：全自动酶标仪实现 96/384 孔高通量检测，速度较手动提升 10 倍，部分集成荧光、化学发光功能，拓展检测范围。

（三）应用期（21 世纪至今）：多领域落地

医疗诊断：成为传染病（乙肝、新冠）、肿瘤（CEA、CA125）、自身免疫病的常规检测技术，如乙肝五项 ELISA 检测灵敏度达 0.1ng/mL；

食品安全：检测药物残留（青霉素、瘦肉精）、微生物毒素（黄曲霉素），如牛奶青霉素残留检测限 0.1μg/kg，远低于国标；

环境监测：检测水体、土壤中的农药残留、重金属结合蛋白，支撑生态评估。

三、ELISA 的核心基础概念：抗原与抗体

（一）抗原：检测的靶向核心

完全抗原：同时具备免疫原性（刺激机体产抗体）与免疫反应性（与抗体结合），如蛋白质、细菌、病毒等，例如 BSA 可刺激小鼠产生抗 BSA 抗体，且能与该抗体结合；

半抗原（不完全抗原）：仅具免疫反应性，需与蛋白质载体（BSA、OVA）偶联才获免疫原性，如氯霉素、青霉素等小分子，适配 ELISA 检测食品中小分子污染物。
抗原决定簇：抗原表面决定特异性的 6-12 个氨基酸 / 碳水基团，是抗体识别的关键位点，其特异性直接决定 ELISA 检测准确性，避免交叉反应。

（二）抗体：检测的识别工具

单抗与多抗：

单抗：单一 B 细胞克隆产生，针对单个抗原决定簇，特异性强、批次稳定，适用于肿瘤标志物等精准检测；

多抗：多种 B 细胞产生，针对多个抗原决定簇，亲和力高、成本低，适用于低丰度抗原捕获；

一抗与二抗：

一抗：直接结合目标抗原，如抗 HBsAg 抗体检测乙肝表面抗原；

二抗：针对一抗恒定区（如羊抗小鼠 IgG-HRP），偶联酶实现信号放大，简化流程且提升灵敏度。

四、总结与展望