蛋白质是细胞功能的核心执行者，但约 80% 的蛋白需通过蛋白 - 蛋白相互作用（PPI）形成复合体或动态结合，才能参与信号传导、代谢调控等关键生理过程。PPI 异常与癌症、神经退行性疾病等密切相关，例如 p53 与 MDM2 的异常结合会导致抑癌功能失活，推动肿瘤发生。因此，精准解析 PPI 机制是理解细胞功能、开发靶向药物的关键。目前，研究人员已建立多种 PPI 检测技术，本文将聚焦 4 类核心技术（免疫共沉淀、串联亲和纯化、酵母双杂交、荧光共振能量转移），解析其原理、流程与应用，为相关研究提供参考。
免疫共沉淀（Co-IP）是基于抗原 - 抗体特异性结合的经典技术，核心是用诱饵蛋白抗体捕获其复合体，再鉴定互作蛋白，能反映生理状态下的天然 PPI。
优势在于检测天然构象蛋白，结果可信度高，可结合 Western blot（验证已知互作）或质谱（筛选未知互作）；局限是依赖高质量特异性抗体，灵敏度低（仅检测高亲和力 PPI），且需确保细胞裂解后复合体完整。
预冷 PBS 洗涤细胞，刮取后离心收集，加 RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制剂），4℃高速离心取上清；
总蛋白液中加 Protein A 琼脂糖珠孵育 30 分钟，离心去除非特异性结合杂蛋白；
调整蛋白浓度至 5-10 μg/μL，加诱饵蛋白抗体，4℃孵育过夜；
加琼脂糖珠孵育 2 小时，离心收集复合体，用 RIPA（或 PBS）洗涤 3 次；
加 2× 上样缓冲液煮沸变性，离心取上清电泳，后续通过 Western blot 或质谱鉴定互作蛋白。
图1 COIP实验操作流程示意图
串联亲和纯化（TAP）通过双标签连续纯化，获得高纯度天然蛋白复合体，适用于大规模筛选 PPI 网络。
构建含双标签（如 Protein A-CBP）的诱饵蛋白融合质粒，先通过标签 1（Protein A）结合 IgG 亲和柱纯化，TEV 蛋白酶酶切后，再通过标签 2（CBP）结合钙调蛋白亲和柱纯化，大幅降低杂蛋白污染。优势是假阳性低、可检测稳定与瞬时 PPI；局限是标签可能影响蛋白构象，螯合剂可能破坏部分复合体。
导入双标签融合质粒至宿主细胞，验证融合蛋白表达；
温和裂解细胞（避免强变性剂），离心取总蛋白液；
上样至 IgG 亲和柱，洗涤后加 TEV 蛋白酶酶切，收集含 CBP 标签的复合体；
上样至钙调蛋白亲和柱，洗涤后用 EGTA 洗脱，获得高纯度复合体；
电泳后通过质谱鉴定互作蛋白。 
图2 TAP实验操作流程示意图
酵母双杂交（Y2H）基于转录激活因子结构域分离特性，适用于验证已知 PPI 或筛选未知互作，1989 年由 Fields 首次报道。
真核转录激活因子（如 GAL4）含 DNA 结合域（BD）与转录激活域（AD），二者靠近才启动报告基因表达。将诱饵蛋白与 BD 融合、猎物蛋白与 AD 融合，共转酵母营养缺陷型菌株：若 PPI 发生，BD 与 AD 靠近，激活报告基因（如 URA3、LacZ），酵母可在缺陷培养基生长（图 3）。
图3 酵母双杂交原理图
优势是操作简便、成本低、灵敏度高；局限是假阳性高（非生理性互作），仅适用于核蛋白，无法反映翻译后修饰对 PPI 的影响。实验需设对照排除假阳性，通过营养筛选与显色反应双重验证。
荧光共振能量转移（FRET）在活细胞内动态监测 PPI 的时空变化，是可视化研究 PPI 的关键技术。
供体荧光分子（如 CFP）与受体分子（如 YFP）距离 < 10 nm 且光谱重叠时，供体能量转移给受体，导致供体荧光减弱、受体荧光增强。将诱饵蛋白与供体融合、猎物蛋白与受体融合，共转活细胞后，检测荧光强度变化：FRET 信号升高表明 PPI 发生。优势是实时动态、高分辨率、非侵入性；局限是对荧光对要求高，易受背景荧光干扰。
生物信息学是 PPI 研究的重要辅助，目前有综合数据库（如 STRING、BioGRID）、预测数据库（如 PPIpred）与专业数据库，可整合实验数据、预测未知 PPI，但预测结果需实验验证。未来，PPI 技术将向更高分辨率（单分子 FRET）、更广适用性（膜蛋白 Y2H 系统）、更精准调控（结合翻译后修饰分析）发展。这些技术的进步，将为解析疾病机制、开发靶向 PPI 药物（如抑制 p53-MDM2 互作药物）提供更有力的支撑。
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