肺癌作为全球致死率高居前列的恶性肿瘤，死亡病例约占所有癌症的 1/5。近年来，PD-1/PD-L1 免疫检查点抑制剂的问世，彻底革新了肺癌治疗范式。然而，肿瘤微环境的复杂性与高度异质性，深刻影响着抗肿瘤免疫应答与癌症免疫逃逸进程，导致单一免疫标志物的预后指导价值受限。
为此，研究者采用多色免疫组化（mIHC）技术，对 98 例非小细胞肺癌（NSCLC）患者肿瘤免疫微环境中四大核心靶点 ——PD-1、PD-L1、抗肿瘤 T 细胞标志物 CD8 及免疫抑制 Treg 标志物 FOXP3 的表达特征展开系统性解析，旨在明确其在 NSCLC 患者预后评估与风险分层中的潜在价值。相关研究成果已发表于《Frontiers in Immunology》（IF=7.561）。
💯核心研究结论：
1、瘤周腔室中 CD8⁺与 FOXP3⁺免疫细胞浸润密度显著高于瘤内区域，结合免疫细胞的亚区特异性浸润模式及 PD-1/PD-L1 表达水平，可有效预测患者预后。
2、对 CD8/FOXP3 及 PD-1、PD-L1 免疫检查点表达水平进行无监督聚类分析显示，CD8/FOXP3 与免疫检查点的低表达特征，或可作为患者对靶向调节性 T 细胞（Treg）治疗应答的潜在标志物。
3、基于多因素 Cox 回归模型构建的风险评分，是评估非小细胞肺癌（NSCLC）患者预后的独立预测因子。
💯研究结果：
1、基于多色免疫组化（mIHC）技术解析 NSCLC 组织的肿瘤免疫微环境表型
为明确非小细胞肺癌（NSCLC）组织中原位驻留及浸润免疫细胞的特征，本研究建立并优化了 mIHC 实验流程，用于检测 CD8⁺T 细胞、FOXP3⁺Treg 细胞、PD-1⁺细胞及 PD-L1⁺细胞的表达情况，同时以 PanCK 阳性标记肿瘤组织成分。通过 inForm 软件完成光谱拆分，实现荧光信号的分离与可视化分析（图 1A）。
为明确非小细胞肺癌（NSCLC）组织中原位驻留及浸润免疫细胞的特征，本研究建立并优化了 mIHC 实验流程，用于检测 CD8⁺T 细胞、FOXP3⁺Treg 细胞、PD-1⁺细胞及 PD-L1⁺细胞的表达情况，同时以 PanCK 阳性标记肿瘤组织成分。通过 inForm 软件完成光谱拆分，实现荧光信号的分离与可视化分析（图 1A）。
采用 6 色 mIHC 技术对组织微阵列（TMA）样本进行染色，定量分析 CD8⁺T 细胞、FOXP3⁺Treg 细胞、PD-1⁺细胞及 PD-L1⁺细胞在肿瘤组织与癌旁组织中的浸润密度（图 1B）。借助 inForm 软件进一步区分 PanCK 阳性的肿瘤区与间质区，完成不同区域免疫表型的精准评估（图 1C）。此外，结合模式识别算法对瘤周及瘤内区域的免疫细胞进行定量分析，系统解析 NSCLC 患者不同组织区域的免疫微环境特征（图 1D）。
图1. 使用六色mIHC评估NSCLC的微环境2、NSCLC中高密度肿瘤相关免疫细胞与免疫抑制表型的相关性
研究者按样本来源将NSCLC样本分为肿瘤组织组与癌旁正常组织组，采用六色mIHC技术检测两组样本中肿瘤相关免疫细胞及免疫检查点的表达特征。结果显示，肿瘤组织中CD8⁺、FOXP3⁺及PD-1⁺细胞密度显著高于癌旁正常组织（p < 0.01），而癌旁正常组织中CD8/FOXP3比值显著更高（p < 0.0001）；PD-L1⁺细胞水平在两组间无统计学差异（p = 0.067）。
鉴于PD-1/PD-L1高表达常与患者不良预后相关，研究者进一步以PD-1⁺细胞密度中值及PD-L1表达水平为界，对NSCLC样本进行分组，比较各组CD8⁺、FOXP3⁺细胞的密度差异。结果表明，PD-1高表达组中，CD8⁺T细胞（p < 0.0001）与FOXP3⁺Treg细胞（p < 0.001）密度均显著升高；PD-L1高表达组中，CD8⁺T细胞（p = 0.0192）与FOXP3⁺Treg细胞（p = 0.0201）水平亦显著升高。上述结果提示，CD8⁺、FOXP3⁺细胞浸润与PD-1/PD-L1高表达密切相关，推测在免疫抑制亚型NSCLC中，高浸润CD8⁺T细胞可能诱导Treg细胞浸润增加，进而促使肿瘤通过适应性调控机制上调PD-1/PD-L1表达。
3、肿瘤周围和肿瘤内亚区NSCLC样本表现出不同的免疫亚群和检查点特征
研究者通过热图分析与聚类分析，探究NSCLC肿瘤周围（瘤周）与肿瘤内（瘤内）亚区样本间的潜在关联。基于CD8⁺、FOXP3⁺、PD-1⁺及PD-L1⁺细胞的表达水平，可有效区分瘤周与瘤内组织的独特免疫亚区特征。
对同一患者瘤周与瘤内组织的免疫亚群及检查点表达进行配对比较发现，瘤周区域CD8⁺、FOXP3⁺及PD-1⁺T细胞群体比例显著高于瘤内区域（P < 0.01~0.0001）（图2D-F），而两组间PD-L1⁺细胞比例无显著差异（图2G）。瘤周组织中细胞毒性T细胞（CD8⁺T细胞）富集，提示肿瘤边缘可能存在特异性免疫应答反应，这也为后续聚焦瘤周亚区开展深入研究提供了依据。
图2. 免疫细胞亚群在瘤内和瘤周的差异
4、聚类分析证实：NSCLC 免疫亚群与检查点联合评估具有显著预后价值
研究者采用无监督分层聚类分析，探究瘤周亚区 CD8⁺、FOXP3⁺、PD-1⁺及 PD-L1⁺细胞密度对 NSCLC 患者预后的影响。Kaplan-Meier 生存分析结果显示，单一标志物（CD8⁺T 细胞、FOXP3⁺Treg 细胞、PD-1⁺细胞、PD-L1⁺细胞）的密度水平，均无法对患者生存预后进行有效分层（图 3A-D）。
研究者采用无监督分层聚类分析，探究瘤周亚区 CD8⁺、FOXP3⁺、PD-1⁺及 PD-L1⁺细胞密度对 NSCLC 患者预后的影响。Kaplan-Meier 生存分析结果显示，单一标志物（CD8⁺T 细胞、FOXP3⁺Treg 细胞、PD-1⁺细胞、PD-L1⁺细胞）的密度水平，均无法对患者生存预后进行有效分层（图 3A-D）。
进一步基于免疫细胞密度开展无监督聚类分析，成功鉴定出 3 个生存预后差异显著的患者亚群：
- 簇 1：CD8/FOXP3 比值中等，PD-1、PD-L1 高表达
- 簇 2：CD8/FOXP3 比值低，PD-1、PD-L1 低表达
- 簇 3：CD8/FOXP3 比值高，PD-1、PD-L1 低表达
生存分析显示，簇 3 患者的总生存期（OS）显著优于簇 1 与簇 2（P=0.0486）（图 3E, F）。上述结果提示，基于免疫亚群与检查点的联合聚类分型，可为临床治疗策略选择提供参考：簇 1 患者或可从抗 PD-1/PD-L1 治疗中获益，而簇 2 患者更适合接受靶向 Treg 细胞的干预方案。
图3. 根据CD8+、FOXP3+、PD-1+、PD-L1+细胞密度对患者进行预后分层5、高 CD8/FOXP3 比值联合高 PD-L1 表达，与特定亚组患者的良好生存预后相关
研究者进一步分析 3 个患者亚组中，瘤周区域 CD8⁺、FOXP3⁺、PD-1⁺、PD-L1⁺细胞密度，以及 CD8/FOXP3、CD8/PD-1、CD8/PD-L1 细胞比值的预后价值（图 4A-E）。
研究者进一步分析 3 个患者亚组中，瘤周区域 CD8⁺、FOXP3⁺、PD-1⁺、PD-L1⁺细胞密度，以及 CD8/FOXP3、CD8/PD-1、CD8/PD-L1 细胞比值的预后价值（图 4A-E）。
已有研究证实，高肿瘤浸润性 CD8⁺T 细胞是包括 NSCLC 在内的多种癌症的良好预后指标，但本研究中，肿瘤浸润性 CD8⁺T 细胞密度与全部患者或任一亚组患者的生存预后均无显著相关性（图 3A）。分层分析显示，高 CD8/FOXP3 比值仅能显著提升簇 3 患者的生存率，在其余亚组中未观察到类似效应（图 4B）；而 CD8/PD-1、CD8/PD-L1 比值在所有亚组中均无预后指导价值。上述结果提示，CD8⁺细胞相对于 FOXP3⁺细胞的水平比例，对特定亚组患者具有预后评估意义。
此外，FOXP3 高表达的簇 2 患者（特征为低 CD8/FOXP3 比值）生存率显著偏低（图 3C），这一现象提示，靶向 FOXP3⁺Treg 细胞的干预策略，或可改善该亚组患者体内 CD8⁺细胞的抗肿瘤功能，进而优化预后。对免疫检查点分子的分析显示，PD-1 表达水平在 3 个亚组中均无预后价值（图 4D）；而PD-L1 单分子水平仅在簇 3 中表现出预后价值，且高 PD-L1 表达与更好的生存结局相关（图 3E），该趋势在簇 1 中未被观察到。
综上，高 CD8/FOXP3 比值联合适度 PD-L1 表达，可能通过平衡肿瘤免疫应答效应与免疫抑制微环境的影响，最终为患者带来更优的生存获益。
图4. 根据CD8、CD8/FOXP3、FOXP3、PD-1、PD-L1表达水平分层的亚组患者总生存率(OS)6、EGFR 突变状态与 PD-1/PD-L1 介导的免疫抑制密切相关
既往研究表明，EGFR 突变型非小细胞肺癌（NSCLC）组织中存在 PD-L1 过表达现象，且肿瘤组织 PD-L1 表达水平与肺腺癌的 EGFR 突变状态及不良预后呈正相关。基于此，本研究进一步探讨 PD-1/PD-L1 表达是否与 EGFR 或 ALK 突变状态协同调控肿瘤免疫抑制进程。
既往研究表明，EGFR 突变型非小细胞肺癌（NSCLC）组织中存在 PD-L1 过表达现象，且肿瘤组织 PD-L1 表达水平与肺腺癌的 EGFR 突变状态及不良预后呈正相关。基于此，本研究进一步探讨 PD-1/PD-L1 表达是否与 EGFR 或 ALK 突变状态协同调控肿瘤免疫抑制进程。
聚类亚组分析显示，具有免疫抑制表型的簇 1（18.92%）与簇 2（14.63%）患者，其 EGFR 突变率显著高于无免疫抑制特征的簇 3（0%）（图 5A）；而 ALK 突变率在三个亚组（簇 1：16.22%、簇 2：17.07%、簇 3：10.53%）间无显著差异（图 4B）。上述数据提示，EGFR 突变状态与两种免疫抑制表型密切相关：其一为高肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）密度联合高 PD-1/PD-L1 表达（簇 1），其二为低 TIL 密度联合低 PD-1/PD-L1 表达（簇 2），该结论与既往报道的 “EGFR 突变型 NSCLC 患者普遍高表达 PD-L1” 的结论存在差异。
此外，研究者进一步对比基因突变型与野生型患者免疫细胞的预后价值发现，仅在 EGFR 野生型亚组中，CD8⁺细胞相对 FOXP3⁺细胞的水平比例具有明确预后价值，证实 CD8/FOXP3 比值对该亚组患者的预后评估具有重要意义。
图5. 免疫抑制状态与EGFR或ALK突变的关系7、基于多因素Cox回归构建预后相关免疫风险评分模型
研究者构建了可量化线性风险的免疫评分模型，具体公式如下：风险评分=0.391×CD8⁺细胞密度 + (-0.374)×FOXP3⁺细胞密度 + (-0.396)×PD-1⁺细胞密度 + 0.272×PD-L1⁺细胞密度 + (-0.269)×CD8/FOXP3比值 + (-0.473)×CD8/PD-1比值 + 0.181×CD8/PD-L1比值。
为验证该模型的可靠性，研究者采用TCGA队列对TMA样本构建的风险评分模型进行外部验证，结果与TMA队列数据趋势一致，即高危评分与患者不良生存预后呈相关性（P=0.0558）。该评分模型以瘤周亚区的免疫指标为核心变量，通过整合各指标间的复杂相互作用，精准反映NSCLC患者的预后状态。
此外，研究者通过时间依赖性ROC曲线分析，评估该风险评分模型预测NSCLC患者预后的敏感性与特异性。结果显示，该模型预测患者1年、3年及5年总生存期（OS）的曲线下面积（AUC）分别为0.784、0.698和0.722，提示模型具有良好的预后预测效能。
进一步分析临床病理特征与风险评分的关联性发现，高淋巴结分期（P=0.03）及高AJCC分期（P=0.02）患者的免疫风险评分显著高于低淋巴结分期、低AJCC分期患者，进一步证实该免疫风险评分模型具有重要的临床预后评估价值。
💯总结与展望
本研究围绕非小细胞肺癌（NSCLC）患者预后评估展开，通过多色免疫组化（mIHC）技术解析肿瘤组织中核心免疫细胞与免疫检查点的表达特征，结合无监督聚类分析明确：高 CD8/FOXP3 比值、低 PD-1/PD-L1 表达及无 EGFR 基因突变，可作为 NSCLC 患者预后良好的联合预测标志物。
本研究围绕非小细胞肺癌（NSCLC）患者预后评估展开，通过多色免疫组化（mIHC）技术解析肿瘤组织中核心免疫细胞与免疫检查点的表达特征，结合无监督聚类分析明确：高 CD8/FOXP3 比值、低 PD-1/PD-L1 表达及无 EGFR 基因突变，可作为 NSCLC 患者预后良好的联合预测标志物。
基于 CD8/FOXP3 比值与 PD-1/PD-L1 表达水平的聚类分型，能够实现患者的精准分层，为临床制定个体化免疫治疗策略（抗 PD-1/PD-L1 治疗或靶向 Treg 细胞治疗）提供重要参考。此外，本研究构建的免疫风险评分模型，可有效评估 NSCLC 患者预后，具有较高的临床转化价值。
未来研究将进一步聚焦肿瘤微环境的高度异质性，深入探究 CD8、FOXP3、PD-1、PD-L1 等免疫分子的空间分布特征，以期更精准地指导患者分层与临床免疫治疗方案的优化。
多色免疫组化（mIHC）哪里有？
乐备实提供一站式组织学染色服务，IHC、mIHC等：
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