肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF）是通过支气管肺泡灌洗术获得的肺部特异性液体样本，其成分直接反映肺泡表面及肺间质的微环境状态。在呼吸系统疾病研究、病原体检测及生物标志物探索中，BALF具有极高的应用价值。然而，BALF中生物分子（尤其是蛋白质及代谢小分子）的稳定性极易受采样后处理流程的影响。因此，建立并严格遵守标准化的样本采集、前处理及保存规范，是确保后续检测结果准确性、可重复性及生物学真实性的首要前提。本文将系统阐述BALF样本的标准操作流程、关键前处理步骤及其背后的科学原理。

一、样本采集与初步处理

BALF的采集需在临床标准操作规程下，由专业人员在无菌条件下通过纤维支气管镜进行。通常使用预热至37℃的无菌生理盐水进行灌洗，并立即回收灌洗液。获取的原始BALF为含有细胞、微生物、肺泡表面活性物质及可溶性成分的混合液。

核心前处理流程如下：

1、初次低速离心： 将新鲜获取的BALF样本置于4℃预冷的离心管中，于4℃条件下，以300×g的离心力离心10分钟。此步骤旨在沉淀灌洗液中的大部分细胞（如肺泡巨噬细胞、淋巴细胞、脱落上皮细胞等），而将细胞因子、抗体、代谢产物等目标可溶性物质保留于上清液中。离心后，小心吸取上清，转移至新的预冷离心管中。为避免细胞碎片干扰，建议弃去贴近细胞沉淀层的少量上清。

2、二次高速离心： 为最大程度去除残留的细胞碎片、微小颗粒及可能形成的不溶性聚合物，建议对初次离心的上清液进行二次离心纯化。将上清液于4℃条件下，以3000×g的离心力再次离心10分钟。此次离心能进一步澄清样本，获得高纯度的细胞游离上清，这对于后续高灵敏度检测（如质谱检测、ELISA超敏检测）至关重要。

二、样本分装、保存与添加剂使用规范

离心后的处理步骤直接决定了生物标志物的保存质量，必须严格按照时效性与低温原则执行。

1、及时分装与冻存： 离心澄清后的BALF上清应立即进行分装。分装的体积应根据下游实验的单次用量需求确定，通常为50-200 µL/管，旨在避免反复冻融。从离心结束到完成分装并置于-80℃超低温冰箱冻存的总时间间隔不应超过2小时。延长室温或4℃下的暴露时间会导致蛋白降解、代谢物转化或微生物生长，引入不可控的变异。

2、全程低温操作： 自BALF离开人体后，所有处理步骤均应在4℃冰上或冷库环境中进行。使用预冷的离心机、离心管和移液器吸头，以最大限度抑制样本中各种酶（如蛋白酶、磷酸酶、代谢酶）的活性。

3、酶抑制剂的针对性添加（关键步骤）：

👉应用场景： 当研究目标涉及多肽类激素（如GLP-1、神经肽Y）、某些细胞因子或不稳定代谢小分子时，样本中的内源性蛋白酶（特别是二肽基肽酶IV，DPP-IV）会迅速降解这些目标物，导致检测值严重偏低甚至假阴性。

👉操作规范： 在完成二次离心并取上清后，如需进行上述标志物检测，必须根据目标物特性及拟采用的检测试剂盒说明书要求，在分装冻存前向样本中添加特异性酶抑制剂。

👉推荐方案： 针对DPP-IV的降解作用，建议添加Sigma公司的DPP4-M（DPP-IV酶抑制剂），工作终浓度通常为1 mM。同时，为广谱抑制其他蛋白酶活性，应联合使用复合蛋白酶抑制剂鸡尾酒。添加后，轻柔混匀，再进行分装与-80℃冻存。未经抑制剂处理的样本，即使立即冻存，也无法有效保护对酶解敏感的标志物。

三、储存与运输标准

👍长期储存： 分装后的BALF样本应保存于-80℃超低温冰箱。在此温度下，大多数酶活性和化学降解反应被极大抑制。必须明确标记，避免任何形式的反复冻融。每冻融一次都可能引起蛋白聚集、沉淀或活性丧失。

👍样本标记： 为便于管理和避免混淆，样本管标记应清晰、简洁、耐久。建议采用简单的数字或字母数字组合编号体系（如：BALF-001, BALF-002…）。所有样本信息应记录于独立的样本管理电子表格中。

👍低温运输： 样本如需异地转运，必须使用足量的干冰（固态二氧化碳）进行运输，确保运输全程样本处于冰冻状态（通常要求干冰量能使样本在预计运输时间的三倍时长内保持冻结）。运输容器需符合生物安全及危险品运输规定。运输前应确认接收方的储存条件就绪。

四、技术要点总结与展望

标准化是BALF样本转化为可靠科研数据与临床诊断依据的生命线。其核心在于：

✔️快速低温： 从采集到冻存的“冷链”无缝衔接。

✔️分级纯化： 通过300×g及3000×g两级离心策略，高效分离细胞与可溶性成分。

✔️主动保护： 针对目标分析物的化学特性（尤其是对酶解敏感的代谢标志物与多肽），主动添加特异性酶抑制剂，从分子层面固定样本状态。

✔️分装管理： 通过一次性分装，杜绝反复冻融带来的降解。

随着多组学技术（蛋白质组学、代谢组学、脂质组学）在呼吸系统疾病研究中的深入应用，对BALF样本前处理的要求将愈加精细化和差异化。未来，针对不同研究目的（如病原体宏基因组、外泌体、氧化应激标志物）的专用前处理试剂盒与自动化操作平台，将进一步提升BALF样本库的质量与科研价值。严格遵守上述规范，是确保从“样本”到“数据”转化过程科学、严谨的第一步，也是所有基于BALF的研究得以成立与互相对话的基石。

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