一、引言

   在基因工程操作中，将目的基因片段导入宿主细胞并实现稳定复制与表达，是获取重组DNA的核心环节。该过程通常涵盖三个关键步骤：目的基因与载体的体外连接、重组载体向受体细胞的转化，以及阳性克隆的筛选与鉴定。各步骤之间的衔接效率直接决定重组成功率。本文旨在系统阐述上述技术环节的实验设计原理、操作策略及其优化路径，以期为基因克隆研究提供理论参考与方法支撑。

二、目的基因与载体的连接

（一）连接反应的分子基础

   目的基因与载体的体外连接依赖于DNA连接酶的催化作用，该酶能够在双链DNA分子间形成磷酸二酯键，完成相邻核苷酸链的连接。常用的连接酶包括T4 DNA连接酶及大肠杆菌DNA连接酶，其中前者具有更为广泛的底物适应性，可有效连接黏性末端与平末端。

（二）载体预处理策略

   为抑制载体自身环化，提高重组效率，需对载体DNA进行去磷酸化处理。常用碱性磷酸酶去除载体5'-端磷酸基团，使载体无法不经插入片段而完成环化。此外，双酶切策略可产生非互补的黏性末端，从根本上杜绝载体自连的可能性，是目前广泛采用的方案。

（三）插入片段制备与连接体系优化

   目的基因片段通常需经PCR扩增并纯化，末端修饰取决于载体设计。若采用TA克隆策略，需在扩增引物中引入腺嘌呤突出端；若采用定向克隆策略，则需引入对应限制酶切位点。连接体系中，插入片段与载体的摩尔比通常设定为3:1至5:1，反应温度多维持在4℃至16℃区间，反应时间不少于4小时以提升连接效率。

三、重组载体的转化

   （一）受体细胞的感受态诱导

转化效率高度依赖受体细胞的生理状态。常用方法包括氯化钙处理法制备大肠杆菌化学感受态细胞，通过对数期菌体在低温条件下与钙离子共孵育，增加细胞膜通透性；电转化法则采用短暂高压脉冲使DNA穿越膜结构，适用于对转化效率要求较高的实验场景。

   （二）热激转化与电穿孔转化

化学感受态细胞的转化需经42℃热激处理，促进外源DNA进入胞内；电转化则无需热激，通过调控电压及电脉冲时长实现对不同菌株的高效转化。两种方法均需在转化后加入富集培养基进行短时恢复培养，以表达抗性基因，为后续筛选奠定基础。

   （三）转化效率影响因素

转化效率受多重因素制约，包括DNA纯度、浓度、盐离子强度、温度控制精度及细胞密度等。过高浓度的DNA可能引起转化抑制，而残留的乙醇或酚类物质则可显著降低细胞活力。因此，连接产物的纯化常被推荐作为转化前的重要处理步骤。

四、阳性克隆的筛选与鉴定

（一）基于抗生素抗性的初步筛选

   重组载体通常携带抗生素抗性基因，转化后菌体在含有相应抗生素的平板上生长形成单菌落，非转化菌则被抑制。该策略虽简便高效，但无法区分载体自连与正确重组，需配合二级筛选方案进一步确证。

（二）蓝白斑筛选系统

   蓝白斑筛选基于β-半乳糖苷酶α互补原理，载体携带LacZ基因片段，在含有X-gal及IPTG的培养基中，非重组菌落呈现蓝色；目的基因插入后将破坏该基因阅读框，重组菌落则为白色。该方法可直观识别重组克隆，但须确保载体具备完整筛选元件且插入方向正确。

（三）菌落PCR与限制酶切鉴定

   菌落PCR是快速鉴定阳性克隆的常用手段，采用特异性引物直接对单菌落进行扩增，依据产物大小判断插入片段是否存在及长度是否符合预期。该方法避免质粒提取步骤，适用于大批量克隆筛选。进一步可采用质粒提取结合限制性内切酶酶切分析，对重组质粒进行结构验证。

（四）测序确证

   作为金标准的DNA测序能够提供重组载体序列的最终确证信息。通过载体通用引物或插入片段特异性引物进行双向测序，可确认插入片段方向、序列完整性及是否发生突变。该步骤在功能基因研究及表达载体构建中不可或缺。

五、结语

   目的基因的连接、转化与克隆筛选构成了分子克隆技术的核心链条。通过合理设计连接策略、优化转化条件，并采用多层级筛选鉴定方法，可显著提高重组子获取效率与准确性。随着合成生物学与自动化克隆技术的发展，上述环节正向高通量、系统化方向演进，进一步拓展了基因操作技术的应用边界。