一、引言

   核糖核酸（RNA）提取是分子生物学研究的基础性技术环节，其质量直接影响后续逆转录定量聚合酶链式反应、转录组测序及基因表达分析等实验结果的可靠性与可重复性。核糖核酸酶（RNase）广泛存在于环境、实验器材及人体皮肤表面，具有极高的稳定性和催化活性，且无需辅助因子即可降解RNA分子。因此，在RNA提取全流程中建立系统性的RNase污染防控体系，是保障RNA完整性与纯度的关键前提。本文从污染来源识别、实验环境控制、耗材处理、试剂配制及操作规范五个维度，系统阐述RNase污染防控的技术策略。

二、RNase污染来源的系统性识别

2.1 外源性污染来源

   外源性RNase主要来源于实验操作者、实验室空气、共用设备及非专用耗材。人体皮肤、唾液、毛发等均含有高浓度RNase，操作过程中未佩戴手套或口罩、手套接触非无菌表面后未及时更换，均可导致污染转移。此外，公共实验台面、移液器、离心机转子、制冰机等设备表面若未经过RNase清除处理，亦构成潜在污染源。

2.2 内源性污染来源

   内源性RNase主要来源于所处理样本本身。富含RNase的组织类型，如胰腺、脾脏、肝脏及某些植物组织，在裂解释放RNA的同时亦释放大量内源性RNase。若裂解缓冲液未能及时抑制RNase活性，或样本裂解不完全、操作时间过长，RNA将迅速被降解。

三、实验环境与耗材的RNase清除处理

   3.1 工作区域的物理隔离与清洁

应设立专用的RNA操作区域，该区域需与常规分子生物学实验室、尤其是聚合酶链式反应区域及微生物操作区域物理隔离。操作台面在使用前应以0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水或商品化RNase清除剂擦拭，并辅以紫外灯照射至少30分钟。紫外辐射可使RNA分子发生交联，亦能使RNase蛋白结构变性，从而降低其活性。

   3.2 耗材的预处理与选用

所有接触样本或试剂的耗材，包括微量离心管、移液器吸头、研钵、匀浆器等，均应选用经认证无核酸酶（RNase-free）的商品化产品。若需自行处理，可采用下述方法：玻璃器皿需经180℃干热灭菌4小时以上；塑料耗材可采用0.1% DEPC水浸泡过夜后高压灭菌，以分解残留DEPC；电泳槽等设备需以3%过氧化氢或0.5%十二烷基硫酸钠溶液浸泡处理，并以DEPC处理水充分冲洗。

四、试剂配制与储存中的RNase控制

4.1 溶剂与缓冲液的RNase去除

   配制RNA相关试剂所需的水相溶剂，必须使用经DEPC处理并高压灭菌的超纯水。DEPC可通过修饰RNase活性中心组氨酸残基的咪唑环而使其失活，常用终浓度为0.1%，处理时间不少于12小时。需注意的是，Tris缓冲液可与DEPC发生反应，因此Tris溶液不适宜采用DEPC处理，应直接使用经认证无核酸酶的商业化产品。

4.2 试剂的分装与储存策略

   频繁冻融可导致RNA稳定性下降，亦可能引入反复取用过程中的污染。所有RNA相关试剂，包括裂解液、洗涤液、洗脱液等，应在首次使用前按单次实验用量进行小规格分装，储存于-20℃或-80℃备用。分装过程应在超净工作台内完成，并严格使用无核酸酶耗材。

五、样本处理与RNA提取过程中的操作规范

   5.1 样本采集与保存

新鲜组织离体后应尽快进行裂解处理，或立即投入液氮速冻，随后转移至-80℃长期保存。速冻过程可瞬时终止细胞内源性RNase的活性，防止RNA降解。冷冻样本在匀浆前不宜反复冻融，且应直接在冷冻状态下加入裂解液进行匀浆。

   5.2 裂解与匀浆环节的控制

当前广泛应用的异硫氰酸胍-酚仿抽提法，其核心机制在于高浓度异硫氰酸胍可同时裂解细胞并强烈变性RNase。操作中应确保样本与裂解液充分接触，匀浆过程宜在冰浴条件下快速完成，以抑制局部升温引发的酶促反应。对于纤维组织或细胞壁较厚的植物样本，需延长匀浆时间或增加机械破碎强度，以确保RNase被充分变性失活。

   5.3 相分离与沉淀步骤的优化

氯仿抽提后离心分离水相时，应避免吸取中间界面蛋白层及下层有机相，以免引入蛋白污染及残余RNase。异丙醇沉淀RNA时，温度不宜过低（通常推荐室温或-20℃），时间不宜过长，以避免盐类共沉淀。沉淀后的RNA应以75%乙醇洗涤两次，充分去除残留盐离子与有机溶剂，乙醇溶液应使用DEPC处理水新鲜配制。

六、RNase污染防控的质量控制与验证

6.1 实验系统的阴性对照设置

   每批次RNA提取实验中，应设置无样本的空白裂解液对照，全程同步操作。该对照产物经后续逆转录及扩增后应无特异性条带或Ct值大于预设阈值，以此验证实验体系无RNase污染残留。

6.2 RNA完整性评估

   RNA完整性可通过琼脂糖凝胶电泳或微流控芯片电泳进行评价。哺乳动物总RNA电泳图谱应呈现清晰的28S与18S核糖体RNA条带，且28S条带亮度约为18S的两倍。若出现弥散条带、小分子量片段增加或核糖体条带比例倒置，则提示提取过程中存在RNase污染或操作不当。

七、结语

   RNA提取过程中的RNase污染防控是一项贯穿“人、机、料、法、环”各要素的系统性工程。通过建立专用操作区域、使用无核酸酶耗材、规范样本处理流程以及设置合理的质量控制节点，可有效抑制RNase活性，保障RNA的完整性与得率。当前，单细胞转录组学与微量样本RNA分析技术对RNA质量提出了更高要求，未来仍需在超微量样本的RNase瞬时抑制、自动化提取设备的洁净度维持等方面开展深入探索。

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